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临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究

杨海燕  
【摘要】: 志贺菌属细菌又称痢疾杆菌,它是引起细菌性痢疾(菌痢)的主要病原。本病是全球流行的传染病,尤其在卫生条件相对落后的国家发病率较高。目前我国尽管在菌痢的防治工作中已取得了重大成就,但由于人口众多,经济不发达,且志贺菌菌型复杂,易变迁,各菌型间无交叉免疫等原因,菌痢发病率一直处于较高水平,是我国夏秋季常见的肠道传染病。菌痢自广泛应用抗菌药物治疗以来,志贺菌不断产生耐药株,并呈多重耐药,不仅耐药率高,且耐药产生快及广泛,给本病的防治带来很大困难,从而造成本病蔓延及流行。1996年痢疾志贺菌被WHO认定为耐药性日渐增长给人类带来巨大威胁的细菌。研究志贺菌属的多重耐药机制,克服细菌多重耐药是提高菌痢防治水平的重要课题。大肠杆菌研究发现:AcrAB-TolC多重耐药泵系统在大肠杆菌多重耐药过程中起到重要作用,其耐药机制称之为主动流出机制,该机制是由染色体介导的在一个调节位点控制下的多基因协作表型,即导致细菌多重耐药泵蛋白表达增加,该泵系统可将结构不同的药物泵出细胞膜外,致胞内药物浓度达不到有效浓度,从而使细菌产生多重耐药。已有的研究发现,类似的多重耐药泵在肠道杆菌中广泛存在。为了解志贺菌属细菌的多重耐药机制及探索解决其问题的途径,本研究对临床收集的志贺菌进 郑州大学硕士学位论文 临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究 行PCR扩增编码多重耐药泵蛋白的结构基因acrAB一tolC、运用PCR一SSCP对其突 变性进行检测、N。找hem印迹检测其表达情况,并在实验室研究泵蛋白抑制剂 MC207,1 10对志贺菌的作用。 方法 1.多重耐药株和敏感野生株的筛选:采用琼脂稀释法测定抗菌药物对志贺菌 的最低抑菌浓度(minlrnu工n inllibition coneentration,MIC)。以实验室耐四环素、 氯霉素、氨节青霉素、毗呱酸或环丙沙星的菌株为多重耐药株(multiPle antibiotic resistant,Mar),均敏感的菌株为敏感野生株(丽ld tyPe,WT)。 2.志贺菌细胞内环丙沙星的积聚:应用荧光法测定志贺菌细胞内环丙沙星的 积聚。积聚试验均于37’C水浴中进行,样品用预冷至0℃的0.1 mol几(pH 3.0) 的甘氨酸溶液处理。志贺菌细胞内环丙沙星浓度为OD60。=10时每升菌液细胞内所 含的环丙沙星毫克数表示。 3.多重耐药泵系统acrAB一olC基因的单链构象多态性(P CR一5 5 CP)分析:PCR 扩增acrAB一tolC基因,扩增产物经限制性内切酶EcoRI(Alul)消化(或不消 化),变性后经中性聚丙烯酸胺凝胶电泳,根据单链带数目和位置判断有无基因 突变。 4.采用随机引物法标记探针:将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物杂 交,然后以此杂交的寡核昔酸为引物,在DNA聚合酶I大片段的催化下,合成与 探针DNA互补的DNA链,反应液中含有DIG一dUTP,即形成地高辛标记的DNA 探针。 5.Northem印迹:提取细胞总RNA,行甲醛变性凝胶电泳,将RNA转移至尼 龙膜,在含有探针的杂交液中杂交,应用地高辛检测试剂盒检测杂交结果,根据 杂交条带密度半定量细胞中mRNA表达水平。 结果 郑州大学硕士学位论文 临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究 1.多重耐药株和敏感野生株的筛选:根据临床上分离的141株志贺菌对四环 素、氯霉素、氨节青霉素、毗呱酸或环丙沙星5种抗生素的药敏试验结果,筛选 出64株多重耐药株,6株敏感野生株。 2.志贺菌细胞内环丙沙星的积聚:敏感野生株细胞内环丙沙星稳态浓度约为 多重耐药株Marl的2.5倍,为多重耐药株MarZ的1 .5倍,差异有显著性 (P0 .0001)。加入能量抑制剂CCCP后,多重耐药株Marl细胞内环丙沙星稳态 浓度上升了2.2倍,多重耐药株MarZ上升了0.8倍,敏感野生株上升了0.3倍,各 组之间比较差异有显著性(尸0 .0001)。 3.32株志贺菌属多重耐药株和6株敏感野生株及标准株全部分别扩增出1697 bp、510 bp和1633 bp长度的片段,分别是aerA、aerB和tolc基因的扩增产物, 未发现多重耐药泵基因缺失株。 4.多重耐药泵系统acrAB一to1C基因的单链构象多态性(P CR-SsCP)分析:对38 株临床分离志贺菌属细菌研究,发现4株多重耐药株acrA基因突变,突变率为 103%;有1株敏感野生株tolC基因突变,突变率为2.6%;未发现acrB基因突变 株。 5.随机引物法标记探针:随机引物法标记的探针浓度分别约为:acrA基因为 990 ng/协l、acrB基因800 ng/协l和tolC基因900 ng/林l。 6.多重耐药泵系统acrAB一tolC表达水平结果分析:多重耐药株Marl、MarZ其 acrA基因表达水平显著高于敏感野生株(尸0.05);多重耐药株Marl、MarZ其 acrB基因表达水平略高于敏感野生株,但统计学比较差异无显著性,F=0.92, 尸二 0.45;多重耐药株Marl、MarZ及敏感野生株其tolC基因表达水平经统计学比 较差异无显著性,F=0.39,尸二0.76。 7.多重耐药泵抑制剂MC一207,110对志贺菌的抑制作用结果分析:在多重耐 药泵基因高表达的一些菌株中作用明显,该抑制剂可通过抑制多重耐药泵从而使 郑州大学硕士学位论文 临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制的研究 环丙沙星对志贺菌相


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