脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB活化及TNF-α 释放的实验研究

【摘要】：背景与目的 内毒素是引起人和动物急性肺损伤(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的主要因素，其化学成分为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。LPS通过与体内单核-巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等细胞膜上的受体结合，启动细胞炎症反应，导致多种细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)和IL-6等大量生成。这些因子进一步作用到其他细胞，引起炎症反应扩大。编码TNF-α、IL-1β和IL-6等的基因，是由核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)控制表达的。NF-κB的过度激活，导致过度强烈的炎性反应，引起肺或其他脏器急性损伤。LPS正是通过激活NF-κB，最终触发全身性炎性反应，从而导致ALI／ARDS的发生。静止状态下，NF-κB以无活性状态存在于胞浆中。在LPS的激活下，NF-κB活化进入核 郑州大学《2(X)3)硕士学位论文 内诱导TNF一a等基因表达。目前常用的检测NF一KB活化的技 术要求较高，且操作复杂。本研究采用激光扫描共聚焦显微镜术 (Confoeal一aser，eanning rl，iel·‘)seopy，C璐M)对LPS诱导的大鼠肺泡 巨噬细胞NF一KB活化进行检测和定量分析，同时检测TNF一a 的表达变化，探讨两项指标之间的联系，进一步阐明ALI/ARDS的 发病机制，为预防及治疗Al刀ARDS提供依据。 方法 收集Wistar大鼠肺泡巨噬细胞并接种于RPMI一1640培养板 上，加人LpS 10m岁L孵育。取刺激o.sh的细胞应用CLSM对NF 一KB的活化进行检测和定量分析。并于刺激0、1、2和4h采用双 抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中TNF一a浓度。 以等量生理盐水作为正常对照组。 结果 l、LPS刺激组肺泡巨噬细胞经C璐M显示:在指示细胞核区 的红色荧光内出现代表NF一KB的绿色荧光，而正常对照组细胞 红色的核区内未出现绿色荧光，绿色荧光主要分布于胞浆区;2、 LpS刺激组肺泡巨噬细胞核区与胞浆区绿色荧光比值(FN/FC)为 1 .053土0.138，明显大于正常对照组肺泡巨噬细胞0.412土0.072， 差异具有非常显著性(尸0.01);3、LPS刺激lh、2h和4h组肺 泡巨噬细胞培养上清TNF一a含量分别为479 .9士1 6.6、348.5士 9.8和251 .3土8.on扩L，明显高于未接受LPS刺激的正常对照组 133.3土6.8、135.2士9.6和138.5士7.3n扩L(P均0.01)。 结论 1、应用CLSM技术对NF一KB的活化进行检测并定量分析， 一2一 脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF一KB活化及TNF一Q释放的实脸研究 具有良好的效果;2、LPS诱导肺泡巨噬细胞NF一KB活化，进而 促进炎症因子TNF一a大量生成;3、LPS刺激lh后肺泡巨噬细 胞释放的rrNF一a达高峰;片且，LPS刺激的肺泡巨噬细胞培养上 清液中TNF一a含量较未接受刺激的正常对照组含量明显增加。 说明内毒素刺激肺泡巨噬细胞活化，活化的巨噬细胞释放炎症因 子，加剧炎症反应;4、LPS刺激的肺泡巨噬细胞NF一KB活性增 强与巨噬细胞释放的TNF一。高峰时相一致。说明内毒素刺激巨 噬细胞NF一KB活化，活化的NF一KB调控炎症因子TNF一a转 录。