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幽门螺杆菌omp11和lpp20基因的克隆及表达产物免疫原性和保护效果研究

张荣光  
【摘要】:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是全球人群中感染率最高的一种革兰氏阴性致病菌,在某些发展中国家,其感染率可高达70%以上。Hp感染与人体慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关。目前,临床上主要采用抗生素治疗Hp的感染,短期内虽有较好的疗效,但由于存在细菌耐药性不断增加、治疗费用高、不能防止复发和重复感染等问题,使这类方案的实用性受限。据文献,免疫接种对Hp感染同时具有预防和治疗的作用,因此,Hp疫苗的研制已成为全球医学研究的热点。 在疫苗研究中,筛选高效的免疫抗原是关键性的环节。目前,虽然已经对多种Hp抗原的免疫活性进行了鉴定,但至今尚未找到一种免疫保护效果令人满意的抗原成分,对更多Hp抗原的免疫活性和免疫效果进行研究,必然是Hp疫苗研究的一个重要发展方向。 据报道,相当多的革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性,这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标,可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用,是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。Omp11是Hp的一种外膜蛋白,其编码基因具有高度的保守性,有望成为重要的免疫抗原,但目前国内外均未检索到有关Omp11抗原活性和免疫保护性的报道。Lpp20是Hp的另一种外膜蛋白,有研究表明,从Hp菌体培养基中提取的Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性,但采用这种方法制备疫苗抗原较为困难,应用基因克隆的方法可以使Lpp20抗原的制备和免疫学研究获得更大进展。因此,本研究对这两种Hp外膜蛋白基因及其表达产物进行了如下探讨。 ①采用本室分离的Hp菌株MEL-HP27和标准菌株NCTC11637,分别对Hp omp11基因和lpp20基因进行克隆和测序,应用生物信息学方法分析基因序列的变异性和表达 郑州大学博十学位论文 幽门螺杆菌。mpll和lpp20基因的克隆与表达产物免疫原性和保护效果研究 蛋白的免疫学分子特征;②分别构建表达这两个基因的原核高效表达载体,并对表达的 重组蛋白进行纯化和免疫原性分析;③建立Hp感染的小鼠动物模型;④应用该动物模 型对ompll和IPp20基因表达产物的免疫保护效果进行研究;以确定这两种重组蛋白作 为疫苗抗原的应用价值,为研制高效的Hp疫苗奠定基础。 实验方法 1.Hp ompll和一ppZo基因的克隆及序列分析 采用本室从郑州胃炎患者胃部分离的Hp菌株MEL一HP27和国际标准菌株 NcTcll637的染色体DNA为模板,用PcR方法,得到omPll基因片段,将其插入到 克隆载体PNEB 193中,用重组质粒转化大肠杆菌,对重组质粒进行酶切鉴定,对插入 片段进行测序。IPP20基因的PCR反应采用MEL一Hp27菌株染色体DNA为模板,余下 克隆过程与omPll基因相同。应用生物信息学软件omiga 2.0和GenBank数据库分析 Hp ompH和lpPZo基因序列的变异性,并分析其表达蛋白分子的免疫学特征。 2 .Hp ompn和IPp20基因高效表达载体的构建、表达和表达产物的纯化和免疫活 性研究 用限制性内切酶从前面构建的重组质粒中切下ompll和IPp20基因,用DNA连接 酶,将目的基因连接到原核表达载体pMAL一cZX中,然后转化大肠杆菌,得到能够使目 的基因和麦芽糖结合蛋白基因融合表达的重组表达载体。用酶切和PCR方法鉴定重组 质粒。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂制备亲合层析柱,纯化表达的重组蛋白 romPll和:Lpp20。应用sDs一队GE方法对表达产物和纯化产物进行分析。用纯化的 romPll、rLPP20和Hp菌体抗原免疫小白鼠,用制备的免疫血清与重组蛋白进行Westem blot反应。 3.建立HP感染的小鼠动物模型 将20只昆明小鼠随机平均分成实验组和对照组。所有动物接种前禁食24hr,禁饮 水4hr。实验组小鼠每只灌喂HP菌液200川(含Hp菌体sx1o勿Fu),对照组用等体积 液体布氏培养基代替菌液。接种后继续禁食4hr。攻击感染共3次,间隔Zd。于末次 攻击感染后28d处死小鼠,剖腹采集胃和其它消化道脏器样品,进行尿素酶实验和组织 切片染色检查。 4.重组蛋白romPll、rLpp20及rHu免疫保护活性分析 rHU为基因重组的Hp hsPA和ureB融合基因的表达产物,来自本室其它研究。采 郑州大学博士学位论文 幽门螺杆菌ompll和lpp20基因的克隆与表达产物免疫原性和保护效果研究 用重组霍乱毒素:CTB为免疫佐剂。将小白鼠分成6组,4个实验组的小鼠分别用 romp 11+rCTB·rL即20+rCTB、rHU+rCTB、rHU+rL即20+rompll经口免疫,这些抗原 均溶于相同的缓冲液中;2个对照组的小鼠分别经口灌喂rCTB和缓冲液。每周l次, 共免疫4次。距末次免疫7d后,各组均用Hp进行攻击感染,每次每只小鼠经口灌喂 Hp菌液200川(5 X IO8cFu),共接种2次,间隔shr。在攻击感染后14d处死小鼠, 取鼠胃作尿素酶定性试验和半定量试验、Hp培养、涂片Gram,s染色镜检和组织学检查, 检测免疫接种对Hp在小鼠胃内定植的影响。 5.统计学分析 应用统计软件SPSS12.O,计量资料的比较采用单因素方差分析,计数资料的比较采 用才检验或Fisher确切概率法,以a=0.05为检验水准。 结果与分析 1·Hp omPll基因和IPp20基因的克隆及序列分析 酶切鉴定和测序结果显示,Hp omPll基因和IPp


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