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新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化

王清勇  
【摘要】:糖尿病(DM)是一种由多病因引起的代谢性疾病,其特点是慢性高血糖,伴随因胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱,是一种严重危害人体健康的常见病。糖尿病可以引起的一些如外周神经病、肾病、视网膜病等微血管并发症和心肌梗死、卒中、脉管炎等大血管并发症。1型糖尿病是由于β细胞破坏引起的,胰岛移植是一个有效的治疗方法。过去胰岛移植后只有10%的患者不再依赖胰岛素注射达1年以上,2000年“艾德蒙顿方案”通过提高患者选择标准、增加胰岛移植数量及新型免疫抑制剂的应用,胰岛移植的成功率极大提高,7个病人全部脱离胰岛素注射和糖化血红蛋白正常1年以上,再次激起了人们对胰岛移植的热情,但胰岛供体缺乏仍是关键问题。干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力,和多种分化潜能的较原始细胞,干细胞研究不断取得的进展,将为糖尿病的细胞治疗提供了一个新的方法。目前报告的存在干细胞的成体组织有:骨髓、血管、骨骼肌、角膜、视网膜、肝脏、脑、皮肤和消化道上皮等。一些动物实验表明,在胰岛中存在一类干/祖细胞,在成体可以再生胰岛。国外有研究表明,来源于人胚胎和成年大鼠胰岛的巢蛋白(Nestin)阳性的祖细胞在体外可以分化出肝细胞和胰腺内外分泌细胞。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由小肠L细胞分泌的胃肠道激素,可刺激胰岛素合成和分泌,近年来研究表明GLP-1在胰岛细胞的发育和分化方面可能发挥重要作用,GLP-1可以促进胰岛生长,影响胰岛拓扑结构,能把多个胰腺外分泌细胞系转化为内分泌细胞。本研究的目的在于分离培养新生大鼠岛源性胰岛祖细胞,观察GLP-1定向诱导其向成熟细胞分 郑州大学医学院2004年硕士论文 新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化 化作用。 材料和方法: 胰岛的分离与纯化,取新生1一3天SD大鼠10一巧只,断头处死,无菌条件 下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中,用眼科剪去除非胰腺组织,4℃Hanks液清 洗三次后,用眼科剪反复剪切至0.5~3组织块,取浓度为19/L的v型胶原酶 溶液10ml与之混合,转入三角瓶消化20一30分钟,至胰岛完全游离,用4℃Hank,s 液低速离心清洗3次,加入PRMn 640完全培养基于37℃,5%COZ,95%空气, 饱和湿度条件下培养20hr后,转瓶以除去成纤维细胞。然后用含2.5m留L碘乙 酸的PRMll640基础培养基培养shr,转瓶弃去贴壁细胞,用基础培养液低速离 心洗涤3次,沉淀物即为纯化胰岛。 将纯化胰岛重新悬浮于即Mll64O完全培养基中,每25cm2培养瓶接种20一30 个胰岛,再加入20 pg/L的成纤维细胞生长因子和20 pg/L表皮细胞生长因子培 养,胰岛很快贴壁,2一3天后长出梭形细胞,用吸管轻轻地吹打,去除悬浮胰岛 细胞,保留贴壁细胞,即胰岛祖细胞。胰岛祖细胞可以反复扩增和传代。把培养 至接近融合时的胰岛祖细胞,撤去生长因子,换以含20nmol/L GLP一1(7一36) NHZ 的RPM工1 640完全培养基培养,诱导细胞分化。 留取分化前及分化后lwk、Zwk、3wk、4wk对应周末培养3d的培养基,测定 胰岛素含量,并观察胰岛干/祖细胞的生长分化情况。诱导分化的胰岛样细胞团 以二硫踪染色观察。4周后用0.25%的胰酶消化分散细胞,做原位杂交和免疫细 胞化学染色。统计学分析采用sPssl 1.0软件处理,数据用万士sD表示,根据 实验要求采用多个样本均数比较的单因素方差分析,以a=0 .05作为检验水准。 结果: 传代的胰岛祖细胞接近融合时,撤去生长因子,加入Zonm。1/L GLP一1(7一36) NHZ的完全培养基诱导分化,5一7d后细胞开始聚集,低倍光镜下呈“波浪样”生 长,此阶段无二硫踪染色阳性细胞。1周后在“波浪”处有圆形细胞团开始形成, 细胞团在培养过程中逐渐增大,2周可增殖为出直径约50 pm的细胞团,其中 大多数镜下为白色,少量周边细胞二硫踪染色为阳性。以后细胞团不断增大,周 边二硫踪着色细胞不断增多。4周时胰岛样细胞团直径可达100 pm以上,大部 分镜下为棕黄色,较为成熟的细胞团二硫踪染色为绊红色。同时,在培养瓶底不 郑州大学医学院2004年硕士论文 新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化 同细胞聚集部位,不断有新的细胞团形成。分化4wk后,每瓶约可形成200个直 径100 pm以上的胰岛样细胞团。 原位杂交结果显示,未分化的胰岛祖细胞中未见胰岛素mRNA的表达。分化 4周后,62.0%的细胞表达胰岛素mRNA。 经免疫细胞化学染色表明,胰岛祖细胞的胰岛素、生长抑素、PDX吐表达阴 性,而Nestin表达阳性。诱导分化4周后,56.5%的细胞表达胰岛素,8.5%的 细胞表达生长抑素,71.既的细胞表达PDX一1,3.5%的细胞表达Nestin。 放射免疫法测定未分化祖细胞培养基胰岛素浓度为0.19士0.03m工u/L。留 取4周对应周末培养基,其胰岛素浓度结果如下:0.22士0.06mIU/L、0.17士 0.04mIU/L,20.67士1.60mIU/L、48.52士4.21mIU/L。分化前两周培养基胰岛素 含量较分化前无明显差别。诱导分化后第3周末,培养基中胰岛素浓度较诱导前 和诱导后lwk、Zwk末明显升高(P0 .05),表明诱导第3周,分化的胰岛样结构 具有胰岛素分泌功能。 结论: 在新生SD大鼠胰岛存在


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