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新型布氏菌皮肤变态反应制剂的实验及应用研究

邓文斌  
【摘要】:布氏杆菌病(Brucellosis)简称布病,是人兽共患的传染变态反应性疾病,布病所具有的迟发型超敏反应为其特异性皮内试验提供了先决条件。皮试诊断方法与血清学诊断方法相结合,对急、慢性布病的诊断具极大价值,同时皮试可使耶尔森09感染引起的布病血清学假阳性反应与布病区分开来。 布氏菌素主要分为两大类:粗制布氏菌素和纯化布氏菌素,统称为变态反应原。粗制布氏菌素主要有强毒菌素、弱毒菌素、犬种菌素、改制菌素、无外源蛋白菌素等。在皮试诊断制品提取过程中,不同菌种、菌体蛋白、脂多糖等因素均影响菌素的质量。本研究采用高速离心法和化学提取法,对布氏菌菌体蛋白、脂多糖、核酸进行提取分析,筛选出三氯醋酸(TCA)和硫酸铵(AS)综合化学反应法,制备布氏菌纯蛋白变应原(Br-PPA),全面开展研究,获得了理想的结果。 材料与对象: 材料:猪种布氏菌Br.S_2,布氏菌104M菌苗,法国纯化布氏菌素(INRA纯化菌素),国产布氏菌素,昆明系小鼠。 观察对象:布病病人,布氏菌感染人群,布氏菌苗免疫人群,结核病人,其它感染病人,非布病疫区健康人。 方法: 制备布氏菌纯蛋白变应原(Br-PPA):猪种布氏菌Br.S_2启开后,接种于土豆葡萄糖琼脂培养基,生化培养箱37℃培养24小时;挑选典型菌落接种于肝琼脂斜面培养48小时;用灭菌生理盐水洗下菌苔,制成浓菌液,浓度为5×10~9菌/ml;15磅20分钟高压灭菌浓菌液;将灭菌液离心,转速4000转/min,分离上清液;取上清液加等量饱和硫酸铵,于4℃过夜进行盐析;将盐析沉淀的蛋白离心,转速10000转/min,取沉淀物;沉淀蛋白用PBS进行溶解,三氯醋酸将溶解蛋白 郑州大学2004年硕士论文 新型布氏菌皮肤变态反应制剂的实验及应用研究 进行沉淀:重复PBS溶解、酸沉淀,用蒸馏水及PBS透析:将蛋白变应原过滤 除菌,真空干燥。 通过测定蛋白、多糖和核酸含量来对Br一P以进行纯度测定;选用18一209昆 明系小鼠进行安全试验:选用300一4009豚鼠用布氏菌104M菌苗免疫来制备致 敏动物;用Br一PPA与参考标准品4IU进行动物标化,进行效价标定。将Br一PPA 稀释为100林g/ml,皮内注射300一4009健康豚鼠,完成致敏效应试验。将稀释的 成品置37℃45天及置4℃半年后取出分别作皮肤试验,并均与参考标准品进行 效价测定,完成稳定性实验。 Br一PpA安全性效果观察:通过对布病病人、布氏菌感染人群、布氏菌苗免 疫人群进行速发型反应发生率比较,确定菌素和Br一PPA对三类人群反应阳性率 差异是否有统计学意义。通过对六类人群进行局部反应和全身反应发生率比较, 确定菌素和Br一PPA对各类人群局部反应和全身反应阳性率差异是否有统计学意 义。 诊断标准研究:通过对菌素和Br一PPA对布病病人、隐性人群和免疫人群的 24h和48h皮内变态反应面积进行比较,确定与菌素组无显著性差异的Br一PPA 面积组,进行敏感性测定。通过菌素和Br一PPA两种变应原对健康人、结核病人 和其他病人等非布病患者变态反应面积比较,确定最佳Br-P队面积组。 所获资料采用统计分析系统SPSS软件处理。 结果: 1.Br一P队纯度测定结果:B卜PPA蛋白含量大于95%,多糖、核酸含量均小于3%, 符合国家生物制品规程要求。 2.安全试验:三批昆明系小鼠腹腔注射一周后,无一死亡,且体重明显增加, 安全性好。 3.效价标定:三批Br一PPA不同预标记量注射豚鼠24h和48h后,其皮肤红肿直 径均随浓度加大而增加;其预标量与参考标准品4JU比值均在1:l士0.2范围内, 达到了国家生物制品规程上的合格要求。 4.致敏效应试验:实验组与对照组皮肤反应未见明显区别,在豚鼠身上24小时 为红肿反应高峰,48小时反应低于24小时。 5.稳定性试验:稀释为100林留ml成品置37℃45天及置4℃半年后取出分别作皮 肤试验,将24h和48h皮肤均径与标准品均径相比,所得结果均在卜1士0.2范围 郑州大学2004年硕士论文 新型布氏菌皮肤变态反应制剂的实验及应用研究 内,符合WHO相关生物制品规程要求。 6.Br-PPA安全性效果观察:对布病病人、布氏菌感染人群、布氏菌苗免疫人群 进行速发型反应发生率比较,菌素和Br一PPA对三类人群的反应阳性率分别是 71.26%和25.22%、50.51%和13.76%、30.48%和9.07%。两者之间对三类人群 的速发型反应差异均有统计学意义(尸灯0.01)。菌素可引起布病病人、隐性感染、 免疫人群不同程度的局部反应,Br一P队未发现局部反应:两者对布病病人、隐 性感染、免疫人群的局部反应差异均有统计学意义(尸丫0.01)。菌素可引起布病 病人不同程度的全身反应,Br一PPA未发现全身反应;两者对布病病人的全身反 应差异有统计学意义(尸灯0.01)。 7.Br一PPA诊断标准研究:Br一PPA多剂量初标化和相近剂量复测结果表明 0.3林创0.lml/人剂量组与参考标准品总均径比值在卜1士0.2范围内。以布病病人对 不同剂量组Br一P队反应均径来确定最佳观察时间为48h。通过对两种变应原皮 内变态反应的面积进行观察,菌素均大于Br一PPA;经厂检验,菌素组与Br一PPA 组1.5xl.5、2.0x2.0、2.5x2.5阳性率差异有显著性(P0.01);而与Br-PPA组 0.5xo.5、1.0义1.0差异均无显著性(P,0.05)。通过两种变应原对非布病患者进 行观察,菌素组与Br一P队组0.5x0.5、1.0火1.0差异均无显著性(P)0.05),菌素 组与Br一PP


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