肝癌消减片段P02在消化系恶性肿瘤中表达状况的研究

【摘要】：肝细胞癌是世界范围内常见的一种高度恶性且预后不良的肿瘤，具有侵袭性强，临床进展快，转移早，预后差的特点。而目前临床上对肝癌的早期诊断尚缺乏特异性的指标，因此，我所朱武凌博士采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)的方法，建立了肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)消减cDNA(complement deoxyribonucleic acid，cDNA)文库，以期在分子水平寻找与肝癌发生发展有关的新因素，从而为更深入的研究肝癌的发生机制，开展早期诊断并进行相关的基因治疗打下坚实的遗传学基础。对肝癌消减cDNA文库的34个阳性克隆采用Northern杂交、反转录PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)进行分析后发现，肝癌差异表达基因的序列表达标签(expressed sequence tag，EST)P02在肝细胞癌中高表达。对P02进行Blast同源性分析得知P02与人翻译调控肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein，TCTP)mRNA的碱基序列高度相似，且两者具有完全相同的开放读码框(open reading frame，ORF)，即两者编码的氨基酸完全相同，因此我们认为P02就是TCTP。但关于TCTP的功能目前尚存在诸多争议。原位分子杂交(in situ hybridization，ISH)是根据核酸碱基配对的原则，利用已知碱基序列并带有标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织原位与待测核酸进行分子杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，应用组织化学和免疫组织化学的方法检测带有标记物的 郑州大学2004年硕士学位论文 肝癌消减片段P02在消化系恶性肿瘤中表达状况的研究 核酸探针与待测核酸杂交体，从而达到在原位对组织细胞中的待测核酸序列进 行定性、定位和相对定量的目的。它是研究基因(尤其是新基因)/EST及其表 达活性的首选方法，它不仅具有良好的定位作用，而且具有更高的敏感性、科 学性和可靠性等特点，已被越来越多的研究人员广泛的应用于基因(尤其是新 基因)/EST功能的研究和测定。 研究目的:检测肝癌消减片段P02在消化系恶性肿瘤如肝癌、食管癌、胃 癌和结肠癌组织及相应正常组织中的表达情况，明确该基因与这些消化系恶性肿 瘤的相关性，以期为它们的早期诊断和治疗提供理论基础。 研究方法:(1)所用组织标本来源于郑州大学第一、二附属医院，郑州市 第四人民医院，河南省肿瘤医院，其中肝癌13例，食管癌18例，胃癌16例， 结肠癌9例。(2)从肝癌组织中抽取总RNA，经反转录PCR后得到P02的PCR产 物，将P02的PCR产物进行纯化后，用随机引物延伸法对P02的PCR产物进行地 高辛标记，应用斑点杂交检测探针灵敏度，然后用标记的P02探针对消化系恶性 肿瘤如肝癌、食管癌、胃癌和结肠癌组织及相应正常组织中的石蜡切片进行 cDNA/mRNA原位杂交，以不加探针的原位杂交液作阴性对照。(3)统计数据采用 SPSS 10.0统计软件进行分析。计数资料采用FISher精确概率法和多个独立样 本的秩和检验，并以Q=0 .05作为显著性检验水准。 研究结果:(l)用斑点杂交法检测探针灵敏度达1.oPg，提示标记探针 的灵敏性比较理想，可用于原位杂交。(2) P02在肝硬化组织中主要定位于肝 细胞中，在肝细胞癌中主要定位于癌细胞的胞浆中，P02在肝硬化和肝癌组织中 的阳性表达率分别为25%和92.3%，两者相比差异显著(尸0.05)。(3) P02 在正常食管、胃和结肠组织中主要定位于基底层细胞中，在食管癌、胃癌和结肠 癌组织中则主要定位于癌细胞的胞浆中，统计学分析表明P02在食管癌、胃癌和 结肠癌及相应正常组织中的阳性表达率亦具有显著性差异(尸0.05)。(4)将 P02在肝癌、食管癌、胃癌和结肠癌中表达的阳性率进行比较，结果发现除P02 在肝癌与结肠癌组织中的表达存在着差异(尸0.05)外，P02在其余癌组织中 的表达两两相比均无明显差异(尸.05)，说明肝癌消减片段P02在消化系恶 性肿瘤中的表达具有一定的组织特异性，但这也可能与结肠癌样本数目太少有 郑州大学2004年硕士学位论文 肝癌消减片段P02在消化系恶性肿瘤中表达状况的研究 关，可进一步扩大样本数目进行研究证实。 结论:l、原位杂交方法可从形态学方面对新发现的基因/EST进行研究，它 较RT一PCR法更可靠，更直观，更经济，并可对基因/EST做出定位分析。 2、使用原位杂交的方法确定肝癌消减cDNA克隆P02是肝细胞癌相关的差异 表达基因的表达序列标签。 3、肝癌相关的cDNA片段P02在肝癌和肝硬化组织中的表达存在着差异，提 示P02在肝癌的发生中起一定的促进作用。 4、肝癌相关的cDNA片段P02在消化系恶性肿瘤如食管癌，胃癌，结肠癌中 亦存在着差异表达，提示P02在食管癌，胃癌，结肠癌的发生中也起一定的促进 作用，有可能成为消化系恶性肿瘤早期辅助诊断和基因治疗的一个靶点。