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新型冠状病毒实验室诊断方法学研究

李振勇  
【摘要】:2002年11月,中国广东省出现了首例传染性非典型肺炎患者,世界卫生组织根据临床症状于2003年3月15日将其命名为严重急性呼吸道综合症——Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS),并于4月16日根据多国协作研究成果,正式宣布SARS的病原体为一种变异的新型冠状病毒(正单链RNA病毒,SARS CoV)。其后,WHO公布的资料显示,全球共计出现非典病人和疑似病人8450例,其中死亡784人,涉及33个国家和地区。由于其病征与感冒、腹泻等常见病病征相似,容易造成临床上的疑诊和误诊。因此,开展相关检测方法和试剂的研发,提供对SARS的早期诊断结果,是进行疾病预防、阻断传播、保护人类自身的首要措施之一,是世界性医学和社会的重大课题。 近两年的研究表明,SARS CoV S蛋白的受体已经很清楚(ACE2),是病毒的主要保护性抗原,N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应,是检测病毒抗体的良好抗原。本研究根据基因扩增、克隆表达和酶联免疫技术,结合生物信息学、F(?)ster等理论,以基因工程、荧光探针、高效核酸杂交等先进技术手段,提出了简单二级结构高熵值靶序列、空间压缩荧光/淬灭、反转录/抗污染整合等新思路,克服了荧光探针背景过高、RNA提取效率低、阳性对照具有潜在传染性/不稳定、反转录和抗污染不能兼顾等技术难题,取得了特异、适合检测的靶序列和引物、TaqMan-BC探针、高效提取方法、病毒样颗粒阳性对照和内对照、反转录/UNG系统抗污染、cDNA富集等技术创新,建立了荧光RT-PCR基因检测、酶免RT-PCR基因检测、酶免抗体检测等方法和试剂,是SARS早期鉴别诊断、病程监测、预后和流病调查的重要手段,社会意义巨大。 一、根据生物信息学理论,将核酸序列简单二级结构新思路引入靶序列的选择上。并根据基因组信息分析结果,获得了适合基因检测的高熵值靶序列;成功地设计了独特的TaqMan-BC荧光探针,将实际检测本底降低2倍以上; 二、建立了高效简便的核酸提取方法,巧妙设计了反转录/UNG抗污染、cDNA富集、扩增一体化组合的反应体系,在有效提高灵敏度的同时彻底解决了PCR实验过程中容易出现的污染问题,检测灵敏度达到45Copies/mL。 三、整合了RT-PCR和快速核酸杂交技术,通过化学交连,将探针高效地固定在


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