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兔同种异体半月板移植的实验研究

阎峻  
【摘要】: 背景与目的 半月板是正常膝关节的重要组成部分,它填充于胫骨平台和股骨髁之间的空隙,能吸收震荡、传导负荷,并在辅助稳定和关节润滑、营养等方面都起着至关重要的作用。半月板严重损伤或切除后,半月板对关节软骨的保护作用丧失,关节软骨的退变加速,导致膝关节不稳定和骨关节炎。 半月板外周三分之一由来自膝关节动脉网的终末支供血,轻度损伤后有自行愈合的可能;而其内侧三分之二无血管终支供血,损伤后一般不能自愈,多需手术治疗。半月板损伤的传统治疗为半月板缝合或半月板切除术,远期随访发现手术后仍会较早出现膝关节软骨退变征象,对半月板缺失或严重损伤无法缝合者,新近的观点是需重建半月板以防止骨关节炎。 同种异体半月板移植因其疗效肯定已经逐渐被学者们所认同,在进行了大量动物实验的同时,正越来越多的应用于临床。研究表明,异体半月板移植后,半月板内的供体源纤维软骨细胞和成纤维细胞渐渐为受体源纤维软骨细胞和成纤维细胞所替代。在受体来源的纤维软骨细胞逐渐增加及半月板超微结构的再塑形阶段,半月板生物力学结构支架比正常半月板脆弱,在不恰当应力的作用下,极易退变或损伤撕裂,导致移植失败,而长时间的制动又大大增加了术后膝关节骨性关节炎的发病率。因此,如何促进异体半月板移植后的超微结构重建,从而改善异体半月板移植的预后,进而有效减缓或阻止临近关节的退变,是当前该领域继续研究的重点。 异体半月板移植后局部的血管重建与细胞分裂增殖至关重要。尤其是后者,自体间充质细胞能否有效的分化为有功能活性的纤维软骨细胞和成纤维细胞并分裂增殖,直接决定了移植半月板的重建;胰岛素可通过胰岛素生长因子受体而介导多种生物学功能,除调节细胞的代谢过程外,还能促进软骨细胞等多种细胞的增殖,而且胰岛素经济易得,很具有临床实用价值。 本研究拟建立兔同种异体半月板移植的实验动物模型;并通过比较单纯同种异体半月板移植、半月板移植并添加胰岛素两种不同情况下移植半月板的转归,从而探讨胰岛素能否改善同种异体半月板移植的预后,并为下一步应用于临床奠定理论基础。该方面的研究至今未见报道。 材料与方法 1.实验动物:30只2.5-3kg雌性中国家兔,平均月龄18周。 2.半月板制备与保存: 无菌手术取出10只供体兔双膝内侧半月板共20个,编号,放入无菌瓶,置入-80℃冰箱保存2周待用。 3.新鲜冻存同种异体半月板移植: 将20个新鲜冻存半月板随即分成A、B两组,每组10个,其中A组术前于室温下在36℃等张生理盐水中快速解冻,B组于相同条件下解冻并加入适量胰岛素,浓度为0.1U/ml,浸泡解冻时间约1小时。 选取与异体半月板供体兔体重接近的兔,每组10只,在切除相应内侧半月板后,即分别行单纯内侧半月板移植、内侧半月板移植并加入胰岛素。 术毕每笼两只饲养,笼中随意活动,并于B组兔患膝关节腔内注入1%胰岛素0.3ml,每周一次,连续5周。 4.于术后第8周末用空气栓塞法处死所有实验兔。离断膝关节上下部分后,打开关节,大体观察半月板及关节内结构,10%甲醛固定、切片、石蜡固定,分别用苏木素、伊红染色及免疫组化切片染色,观察结果。 结果 1.大体观察:术后8周所有半月板移植个体,肉眼下观察均可见移植半月板与外周关节囊和滑膜良好愈着,个别可见半月板后角未固定于胫骨平台后缘,但均与周围关节囊愈着良好,半月板位置基本正常,A组中3例,B组中2例可见移植半月板体部轻度萎缩;滑膜轻度充血;关节腔内无明显积液;部分膝关节内侧胫骨平台和股骨内髁表面轻度粗糙;对移植半月板及关节内部大体情况进行评分后比较,两组之间有显著性差异。 2.组织学观察,移植后第8周,光镜下显示:移植半月板表面大多有高度血管化的滑膜组织覆盖及细胞增殖,纤维软骨样细胞由周边逐渐长入移植半月板中央,半月板内部基本上仍为无细胞核组织或胞核淡红染,显示为无活力细胞;半月板中央部胶原纤维排列稍紊乱,呈波浪状,较稀疏,而周边新生的结缔组织中,胶原纤维排列明显较规则;对移植半月板HE染色结果评分后比较,两组之间有显著性差异。 3.免疫组化切片示:两组移植半月板内新生的软骨细胞均有TIMP-1表达,经图象处理软件分析后得到两组细胞染色的灰度值,SPSS 10.0软件分析比较示两组之间差异有统计学意义。 结论 1.本课题成功构建了兔同种异体半月板移植模型,移植异体半月板采用新鲜冻存的方法保存,移植方法采用单纯将半月板周边与关节囊缝合的方法,结果显示缝合后均可达到良好愈合。 2.HE切片染色显示,移植半月板有新生细胞从周边向中央长入,并由滑膜细胞逐渐化生为纤维软骨细胞;TIMP-1定位于细胞浆,是维持软骨基质正常代谢、转化的重要调节因子,免疫组化切片染色显示,新生软骨细胞有TIMP-1阳性表达,表明其有活跃的分泌胶原基质的能力。 3.胰岛素有促进作用移植半月板纤维软骨细胞增殖的作用,可以帮助移植半月板早期完成其结构与功能的重建,并对防止半月板移植后膝关节软骨的退行性改变有一定作用。但其具体的作用机理及临床应用价值尚需进一步研究。


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