NGR/L-PEI/ASON肿瘤靶向缩合体研究

【摘要】： 反义寡聚核苷酸(ASON)可以与hTERT基因结合，有效地抑制端粒酶的表达，从而抑制肿瘤细胞生长或诱导其调亡，反义技术已经成为一种重要肿瘤治疗策略。用多聚阳离子将ASON缩合成粒径适宜、形态规则的超分子缩合体，是非病毒核酸转运系统研究的一个重要分支。研究表明聚乙烯亚胺(PEI)具有很强的与ASON分子结合的能力，能与ASON分子形成稳定的纳米级缩合体。PEI／ASON缩合体表面可呈正电性，能够非特异性的黏附于带有负电荷的细胞表面，通过液相内吞的方式迅速进入细胞，在体外转染效率高。PEI／ASON缩合体易于制备和修饰，在ASON的体内传染方面表现出了良好的应用前景。 本研究以单因素实验法考察了分支型聚乙烯亚胺／ASON(B-PEI／ASON)缩合体的制备工艺，研究了缩合体的物理化学性质。同时考察了亲水性修饰物的抗凝聚作用和缩合体对ASON的保护作用。研究结果表明，N／P(PEI含有氮原子的摩尔数／ASON含有磷原子的摩尔数)在3.5以上时ASON的包封率即可达到100％；NaCl影响缩合体的稳定性，其浓度超过50 mmol／L，缩合体的粒径即明显增大；pH影响B-PEI中氨基的质子化率，pH超过8.0后由于质子化率变低，缩合体粒径急剧上升；在实验设计的范围内，ASON的浓度对缩合体稳定性没有显著的影响。制备B-PEI／ASON缩合体的优化处方为：pH 7.0、N／P=4.0、C_(ASON)=100μg／ml，在此条件制备的缩合体平均粒径120.6nm，平均zeta电势33.84mv，形态规整，无聚集粘连现象，ASON全部被荷载，能有效地对抗DNaseⅠ对ASON的降解作用。 考察了N／P对线型聚乙烯亚亚胺／ASON(L-PEI／ASON)缩合体包封率的影响，以及右旋糖酐-70(Dextran-70)对L-PEI／ASON缩合体的保护作用。L-PEI／ASON缩合体的优化处方为：pH 7.0、N／P=10.0、C_(ASON)=100μg／ml，此条件下制备的缩合体平均粒径156.7 nm，平均zeta电势36.28 mv，ASON全部被荷载，能有效地对抗DNaseⅠ对ASON的降解作用。在L-PEI／ASON缩合体溶液中加入1％的Dextran-70能显著地降低缩合体对“Cl~-”的敏感度。 为了制备具有肿瘤靶向特性的缩合体，本研究采用N／P=6.5的L-PEI／ASON缩合体作为靶向修饰的底物，以NGR多肽对其进行静电吸附修饰。制备NGR／L-PEI／ASON缩合体的优化处方为：pH 7.0、N／P_(PEI)=6.5、N／P_(NGR)=0.3、C_(ASON)=100μg／ml，此条件制备的缩合体平均粒径128.1 nm，平均zeta电势32.14 mv，缩合体呈不对称的豌豆状，无聚集粘连现象，ASON全部被荷载，能有效地对抗DNasⅠ对ASON的降解作用。 考察了NGR／L-PEI／ASON缩合体的体外促细胞吞噬作用、体内(BALB／C裸小鼠食管癌模型)肿瘤靶向特性和抗肿瘤活性。与游离的ASON实验组相比，NGR／L-PEI／ASON缩合体组显著地促进了EC9706细胞的摄取作用，激光共聚焦荧光显微镜下观察可知，细胞核内的荧光强度甚至超过了胞浆。经皮下注射或尾缘静脉注射，NGR修饰的缩合体均可以进入到瘤体组织，且随时间的延长进入瘤体的药物逐渐增多；未经NGR修饰的缩合体静脉给药后不能被肿瘤组织摄取。静脉给药高剂量组和皮下给药组小鼠瘤体在整个观察期内均生长缓慢，最终测定瘤体的平均体积分别为183.6 mm~3和172.5 mm~3；而空白对照组和正义对照组则分别为469.1 mm~3和393.8 mm~3，有显著性差异。瘤旁皮下注射组及静脉注射实验组均可诱导肿瘤细胞出现凋亡，透射电镜下观察可知，瘤体细胞胞浆凝集，染色质边集，核固缩、碎裂，有类圆形凋亡小体出现，对照组肿瘤细胞未见典型凋亡小体。 本研究以L-PEI作为成核试剂，以NGR多肽作为表面电荷调节剂和靶向修饰剂，采用静电吸附靶向修饰方法制备NGR／L-PEI／ASON缩合体，在体内表现出了很好的靶向性和理想的抗肿瘤活性。