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重组人白血病抑制因子、柔红霉素对DAMI细胞株的作用研究

毛彦娜  
【摘要】: 白血病(Leukemia)是人体造血组织的恶性疾病,也是儿童期发病率最高的一种恶性肿瘤疾病,是五岁以下儿童死亡的主要原因之一,白血病的发生、发展与细胞凋亡(Cell apoptosis)异常有密切关系,凋亡是一种基因(Gene)指导下的细胞主动自我消亡过程,它是正常胚胎发生过程和成人组织器官发育中细胞清除的正常途径,当凋亡通路受到抑制或阻断就可以使细胞永生化而恶变。凋亡涉及到一系列的基因调控(Gene regulation),促进凋亡的基因有Bax、p53家族等。凋亡理论的提出不仅为白血病病因和发病机制开辟了新的领域,而且为白血病的治疗提供了新的思路。 现知许多治疗白血病的传统化疗药物如柔红霉素(Daunorubicin)、甲氨蝶呤(Methotrexate)等都能够通过诱导白血病细胞发生凋亡而起到治疗白血病的作用,化疗几乎是治疗白血病的唯一选择。以儿童急性淋巴细胞白血病为例,二十世纪40年代后期主要局限于寻找有效的单一化疗药物,缓解和生存率很低,二十世纪50年代及60年代初发展了联合化疗和维持治疗。五年无病生存率达10%~20%,此后由于治疗白血病新药的问世,五年无病生存率已经达到50%~80%,近年许多细胞因子的出现为白血病的治疗提供了新的策略。 为探索某些细胞因子和化疗药物对白血病细胞生长的影响,本研究以急性髓细胞白血病细胞(acute myeloid leukemia,AML)株DAMI细胞为靶细胞通过CCK-8法、流式细胞仪及免疫组化法对细胞增殖、早期凋亡指标、细胞周期及P73 基因的表达进行检测,探讨单独或联合应用重组人白血病抑制因子(recombinant human leukemia inhibitory,rh-LIF)和柔红霉素对DAMI细胞的增殖与凋亡的影响,阐明有关机制,为白血病的临床治疗提供理论和实验依据。 方法:将DAMI细胞置于含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基中,37℃,5%CO_2培养箱中悬浮培养,每2~3天传代一次,取对数生长期细胞进行实验。应用细胞增殖实验观察不同浓度的rh-LIF,DNR及两者联合应用对DAMI细胞作用6h、12h、24h、48h后细胞株增殖及活力的变化,用流式细胞仪测早期凋亡指标Annexin V,免疫组化法检测用药前后P73蛋白的表达变化、通过细胞周期测定来分析细胞发生凋亡的周期。全部数据用SPSS13.0统计软件进行处理,结果用均数±标准差((?)±s)表示。方差齐时用两组间的均数比较用t检验,方差不齐时两组间的均数比较用秩和检验,检验水准a=0.05。 结果:1不同浓度的rh-LIF(1,5,10,20,40 ng/ml)对DAMI细胞株作用于6h、12h、24h、48h后,观察细胞株的增殖变化,当rh-LIF浓度较低时(1ng/ml)对细胞的增殖抑制作用不明显(P0.05),而当rh-LIF浓度增高(≥5ng/ml)时,对细胞的增殖抑制作用增强,差异有显著性意义(P0.05),流式细胞仪测定早期凋亡指标发现浓度为1 ng/ml时凋亡不明显(P0.05),≥5 ng/ml时凋亡率增高(P0.05),随着rh-LIF浓度的逐渐增高p73蛋白的阳性表达率也明显增高,差异有显著性意义(P0.05),p73蛋白的阳性表达率与药物浓度和作用时间呈一定的相关。细胞周期分析显示多数细胞被阻滞于G_0/G_1期。 2不同浓度的DNR(0.5,1,2,4,8μmol/L),对DAMI细胞株作用于6h、12h、24h、48h后观察细胞株的增殖变化,浓度0.5μmol/L时抑制作用不明显(P0.05),1,2,4,8μmol/L时,随着浓度加大、时间的延长抑制作用越越明显,差异有显著性意义(P0.05)。0.5μmol/L时细胞开始发生凋亡,在0.5,1,2μmol/L时细胞随着作用时间的延长凋亡率显著增高(P0.05),4,8μmol/L时凋亡率则有下降趋势。0.5,1,2μmol/L时免疫组化显示p73蛋白的阳性表达率增高。4,8μmol/L时p73蛋白的阳性表达率降低。细胞周期分析显示DNR作用于DAMI细胞后被阻滞于G_0/G_1期。 3 rh-LIF与DNR联合作用于DAMI细胞株对细胞增殖的抑制、细胞凋亡率的变化所示比单用rh-LIF的作用强(P0.05),与单用DNR相比无明显差别、 p73蛋白阳性表达率与单用rh-LIF或DNR相比阳性表达率低(P0.05),细胞周期分析显示rh-LIF与DNR联合作用于DAMI细胞后被阻滞于G_0/G_1期。 结论:1.rh-LIF和柔红霉素可抑制DAMI细胞株的生长,呈浓度、时间依赖性;p73蛋白的高表达可能是诱导DAMI细胞株凋亡的机制之一。 2.细胞因子rh-LIF联合化疗药物无明显协同诱导DAMI细胞凋亡的作用。


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