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血清蛋白质指纹图谱在甲状腺癌诊断的临床应用研究

卢秀波  
【摘要】: 甲状腺癌是常见的头颈部恶性肿瘤,约占全身恶性肿瘤的1%,它也是内分泌肿瘤中最常见的恶性肿瘤,占内分泌恶性肿瘤的91.5%,近年来其发病率呈上升趋势。按肿瘤的病理类型,甲状腺癌可分为乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌、髓样癌,其中分化型癌占80-90%,早期予以手术治疗,5年生存率高达75%以上,所以甲状腺癌早期诊断具有重要意义。目前,临床上甲状腺癌的诊断使用超声、CT、MRI、核素扫描、细针穿刺细胞学检查等多种手段,但我国甲状腺癌术前误诊率仍高达40-77%。长期以来,医学界一直寻求对甲状腺癌诊断有临床意义的标记物,发现半乳糖凝集素,包壳素(involucrin),甲状腺过氧化物酶(TPO),白细胞抗原单克隆抗体系统(CD),癌胚纤维连结蛋白等,但是这些标记物只是对某一病理类型的甲状腺癌敏感,限制了其在临床的实际应用。因此,寻找理想的生物标记物,探索和建立一种简单、快速、敏感性高和特异性强的甲状腺癌早期诊断技术已经成了临床医学上的迫切需要。 蛋白组学应用大规模蛋白质分离识别技术,立体、全面地对基因组所表达的整套蛋白质进行分析,从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究,它的飞速发展为肿瘤的研究提供了新的思维和技术平台。 甲状腺癌的发生是多基因多阶段多因素的动力学过程,是癌基因激活和抑癌基因失活的结果,而从功能的角度看,由于运载信息、介导信息流动的媒介是蛋白质而不是基因,它是一种蛋白质组性疾病,在其出现病理变化之前,细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变,通过对蛋白质的动态观察可以筛选出疾病早期的指标和征兆。同时鉴于甲状腺癌发生演变因素的复杂性,监测单一或数个指标对甲状腺癌进行早期诊断不可避免的存在敏感性和特异性矛盾。蛋白组学技术可以高通量的筛选肿瘤不同发展阶段基因表达的各种蛋白质,或通过正常人、相关疾病及肿瘤患者的体液在蛋白质种类和数量上的差异比较,从而发现大量有诊断价值的蛋白质分子,确定和筛选特异的肿瘤标志物。 表面增强激光解吸电离—飞行时间质谱技术(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS),是2002年开发的新型蛋白组学技术,应用基因芯片的设计原理,把层析、质谱等技术合理地与蛋白芯片结合,可检测出传统方法难以鉴定的蛋白质和多肽,具有快速、灵敏、高通量等特点,被用在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌等肿瘤标记物的研究中,有重大的突破。我们利用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌患者、甲状腺良性结节患者和正常人的血清蛋白质组图谱并结合生物信息学方法,筛选特异的标记物,探讨建立可用于甲状腺癌早期诊断和术前定性诊断的血清蛋白质指纹图谱模型。 材料与方法 1.材料 1.1标本108例血清:甲状腺癌40例(Ⅰ-Ⅱ期26例,Ⅲ-Ⅳ期14例),甲状腺良性结节36例(甲状腺腺瘤例、结节性甲状腺肿例),健康对照组32例。所有甲状腺癌和甲状腺良性结节标本均经2位病理学家证实。甲状腺癌中男9例,女31例,平均年龄41岁。 1.2设备表面增强激光解吸电离—飞行时间质谱技术(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS),(PBSⅡ~+ Ciphergen Inc.美国)。主要参数:收集范围为1000-50000;优化范围为2000-30000。 1.3芯片WCX_2为弱阳离子结合芯片。 1.4应用软件和标志物评价指标:应用软件:Ciphergen Software 3.1和Biomarker Wizard;支持向量机(SVM):ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包。评价实验的指标:灵敏度、特异度、Youden指数。 2.方法 2.1血清样本处理:U9溶液处理血清,50mNaNC(pH=4)稀释,Bioprocessor(可含12根芯片)结合反应60分钟,上述NaNC(pH=4)缓冲液清洗芯片,取出芯片风干后点50%饱和的SPA溶液,上机读片。 2.2 SELDI操作: 原始数据先用Proteinchip Software 3.1做校正,总离子强度及分子量的均一化;再用Biomarker wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包中的离散小波过滤噪音,得到初步筛选结果;对初步筛选出来的质荷比峰做个组别数据Wilconxon秩和检验,按照P值得大小比较每一个质荷比峰在甲状腺癌与对照中表达差异的显著性程度。 2.3血清样本分组: 组1:甲状腺癌(40)和健康对照(32) 组2:甲状腺癌(40)和甲状腺良性结节(36) 组3:Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌(26)和Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌(14) 2.4建模方法: 2.4.1初步筛选每组有统计学差异的m/z。 2.4.2生物信息学软件分析数据,用训练集建立判别模型,用测试集检验模型的效力,进一步筛选用于建模的m/z。 2.4.3评价各模型测试集的敏感性、特异性、准确率、阳性预测值和阴性预测值。 结果 1.甲状腺癌组与正常人组的比较: 甲状腺癌组与正常人组质谱数据经过初步筛选得到347个M/Z峰,其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到46个P值小于0.01的M/Z峰,从差异显著蛋白质峰的任意组合中,采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型,得到3个m/z位于6651、6452、6984的标志物,在甲状腺癌低表达,在正常人高表达。联合3个潜在标记物作为输入值,留一法交叉检测,在测试集上甲状腺癌筛查模型的特异性为80%,敏感度为87.5%。 对15例未知血清标本应用已确定的方法测定血清蛋白质质谱,将每例血清蛋白质质谱数据导入已建立的支持向量机模型进行预测,8例甲状腺癌中有8例,7例正常对照中有6例被正确预测,得出该模型的特异性为86%,敏感性为100%。 2.甲状腺癌组与甲状腺良性结节组的比较: 甲状腺癌组和甲状腺良性结节组初步筛选出347个M/Z峰,经Wilconxon秩和检验分析得到6个P值小于0.01的M/Z峰,从差异显著蛋白质峰的任意组合中,采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型,得到5个标记蛋白,3个m/z位3400、3690、2902.6的标记物,在甲状腺癌高表达,在甲状腺良性结节低表达;而2个m/z位于3937、2687.8的标记物与之相反。联合5个潜在标记物作为输入值,用留一法分类器评价模型的预测效果,在测试集上甲状腺癌定性诊断模型的特异性87%,敏感性81%。 该模型进一步用14例血清标本盲法测试,8例甲状腺癌中有7例,6例甲状腺良性结节中有5例被正确预测,得出该模型的特异性为83%,敏感性为88%。 3.Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌组和Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌组的比较 Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌组和Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌组初步筛选出206个M/Z峰,利用判别分析处理数据,得到4个M/Z为2285、2182、2068、2196的标记物,均在Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌高表达,在Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌低表达。以这4个M/Z为峰值的组合,交叉检验Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌检出的准确率77%,Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌检出的准确率86%,总的准确率为80%。 结论 不同的样本需要不同的蛋白芯片,必须根据标本的特征选用。本试验选用的WCX2蛋白芯片在可选用的数种芯片中所结合的蛋白量最多,根据其建立的实验方法具有很好的重复性和稳定性。在信息处理中,本试验根据样本量较小,而分布较整齐的特点,选用了在中小样本模型中推广性、模型选择、过拟和、纬数灾难等问题得到很好解决的SVM。 4.1运用SVM分析方法,联合M/Z在6651、6452、6984的3个峰值在区分甲状腺癌与正常人群对照判别模型中特异性86%,敏感性100%。对从健康人群中筛检甲状腺癌患者具有很好的应用价值。 4.2运用SVM分析方法,联合M/Z在3400、3690、2902.6、3937、2687.8的5个峰值在区分甲状腺癌与甲状腺良性结节的判别模型中特异性为83%,敏感性为88%。对鉴别甲状腺良恶性结节,甲状腺癌术前定性判别具有很好的应用价值。 4.3运用判别分析方法,联合M/Z在2285、2182、2068、2196的4个峰值对Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌检出的准确率77%,Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌检出的准确率86%。提示该判别模型可在术前判断甲状腺癌临床分期,对术前分期的判断有一定的应用价值。 4.4运用SELDI-TOF-MS技术结合生物信息学方法寻找甲状腺癌筛查和定性诊断的血清蛋白标记物,并建立高敏感、特异的判别模型,为甲状腺癌的诊断提供新的方法。


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