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SV40T抗原基因的稳定转染及对人胃癌细胞SGC7901的生物学效应

马慧洁  
【摘要】:猴病毒40(Simian virus 40,SV40)是一种DNA肿瘤病毒,在体外可以转化细胞并诱发动物体内产生肿瘤,在人类多种肿瘤中已检测到SV40基因的存在和表达。SV40与人类肿瘤关系密切,它的致瘤性和转化细胞能力主要与其编码的早期蛋白T抗原(T antigen,Tag)有关。SV40Tag能够和抑癌蛋白p53和Rb等结合并使之失活,导致细胞生长失控和恶性增殖,被认为是SV40Tag致瘤发生的重要机制。SV40Tag可以整合入细胞基因组中破坏其结构和稳定性,反式激活细胞基因的表达并启动宿主DNA的复制转录等。SV40Tag对细胞转化起决定性作用,与细胞增殖及肿瘤发生密切相关,它可以诱发转基因动物产生多种类型肿瘤,被广泛用于肿瘤发生机制的研究。 利用SV40Tag基因与组织表达特异性的启动子相结合,已经成功制备多种转基因小鼠肿瘤模型。H~+/K~+ATPase基因在胃壁细胞中特异性表达,利用胃壁细胞特异性H~+/K~+ATPaseβ亚基启动子建立SV40Tag基因转基因小鼠胃癌模型,可用于胃癌发病机制的研究,同时为胃癌的预防和治疗提供有力的工具。 在以往研究的基础上,本实验将H~+/K~+ATPaseβ亚基启动子驱动表达SV40Tag基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染入SGC7901、EC9706和KB细胞中,通过G418筛选和扩大培养,获得稳定转染的细胞系。应用PCR、RT-PCR和免疫细胞化学染色方法检测SV40Tag基因在稳定转染细胞中的整合与表达情况,并且观察SV40Tag基因的表达对人胃癌细胞SGC7901生物学特性的影响,探讨SV40Tag的作用机制及SV40Tag基因表达与肿瘤发生发展的关系,为进一步转基因动物模型的构建奠定理论及实验基础。 材料与方法: 1.质粒的扩增、提取和酶切鉴定提取质粒pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)/HKSV与pcDNA3.1(-)/SV,利用限制性内切酶酶切鉴定质粒,将质粒用BamHⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2.细胞转染利用脂质体Lipofectamine~(TM)2000,将含有SV40Tag基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/SV和pcDNA3.1(-)/HKSV转染入SGC7901、EC9706和KB细胞中,用G418进行筛选,将获得的阳性细胞克隆扩大培养,得到体外稳定传代的转染细胞系。 3.检测稳定转染细胞中SV40Tag基因的表达SV40Tag基因稳定转染后,从DNA、RNA和蛋白质三个水平上检测SV40Tag基因的整合和表达。提取转染及未转染细胞的基因组DNA,利用Tag基因特异性引物PCR扩增检测SV40Tag基因的表达;提取细胞总RNA,RT-PCR检测SV40Tag基因mRNA的表达;免疫细胞化学染色检测稳定转染及未转染细胞中SV40Tag的表达。 4.检测转染SV40Tag基因的SGC7901细胞生物学特性变化MTT法检测SV40Tag基因转染前后SGC7901细胞增殖能力变化;应用流式细胞术进行细胞周期分析。 5.统计学处理SPSS10.0统计软件对数据进行统计学处理,数值用均数±标准差((?)±s)表示。应用单因素方差分析进行组间差异比较,以α=0.05为检验水准。 结果: 1.质粒的酶切鉴定pcDNA3.1(-)/HKSV用BamHⅠ单酶切电泳,可见到约2.7kb与6.4kb两条DNA条带;pcDNA3.1(-)/SV用BamHⅠ单酶切电泳,可见到约2.7kb与5.4kb两条DNA条带;pcDNA3.1(-)用BamHⅠ单酶切电泳,仅见到一条5.4kb的DNA条带,与预期结果相符,可用于下一步的实验。 2.PCR各组细胞均可扩增出443bp的内参照GAPDH条带,pcDNA3.1(-)/HKSV与pcDNA3.1(-)/SV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞均可扩增出618bp的SV40Tag基因特异性条带,未转染细胞与空质粒转染细胞均无此条带出现。 3.RT-PCR各组细胞均扩增出443bp的内参照GAPDH条带,pcDNA3.1(-)/HKSV与pcDNA3.1(-)/SV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞均扩增出272bp的SV40Tag基因特异性条带,未转染细胞与空质粒转染细胞检测不到此条带。 4.免疫细胞化学染色pcDNA3.1(-)/HKSV与pcDNA3.1(-)/SV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞中均检测到SV40Tag的阳性表达,未转染细胞与空质粒转染细胞无SV40Tag的表达。 5.MTT结果pcDNA3.1(-)/HKSV和pcDNA3.1(-)/SV稳定转染的SGC7901细胞的生长增殖速度比未转染细胞及空质粒转染细胞明显加快,差异有统计学意义(P<0.05),未转染细胞和空质粒转染细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。 6.流式细胞术检测细胞周期结果pcDNA3.1(-)/HKSV与pcDNA3.1(-)/SV稳定转染的SGC7901细胞中G_1期细胞比例减少及PI指数增加,与未转染SGC7901细胞和空质粒pcDNA3.1(-)转染组细胞相比差异有统计学意义(P<0.05),未转染细胞和空质粒转染细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1.pcDNA3.1(-)/HKSV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞中,SV40Tag基因稳定表达。 2.SV40Tag基因的稳定转染促进SGC7901细胞增殖。


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