有机磷农药降解酶发酵条件的优化及酶性质的研究

【摘要】：本文对基因工程菌E.coliBL2l(DE3)/pET30a-mpd的发酵条件进行了优化。通过单因素实验考察了培养基中碳源、氮源、磷酸盐的种类和浓度，发酵液初始pH值、接种量、装液量、发酵温度以及乳糖添加量和诱导时间对有机磷农药降解酶的影响，从中得出利于降解酶合成的上述因素的组成为：甘油为碳源、酵母粉和蛋白胨为氮源、初始pH值8.0，接种量5％，装液量100mL/500mL三角瓶，温度25℃，乳糖在发酵后4小时添加。确定了培养基成分和发酵的基本条件。通过Plackett-Burman实验设计法考察了培养基组成和培养条件中的8个因素对降解酶合成的影响，从中筛选出三个影响降解酶产量的关键因素：甘油浓度、发酵温度和乳糖添加量。其它因素的最适条件为：酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐0.08mol/L，接种量5％，装液量100mL/500mL三角瓶，初始pH8.0，乳糖添加时间发酵后4小时。利用响应面分析进一步考察三个重要因素对降解酶合成的影响，通过回归方程得到上述三个条件的最优值分别为：甘油20.8g/L，发酵温度23.4℃，乳糖添加量13.08mmol/L。因此，优化后的最佳培养基组成和培养条件为：酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L K_2HPO_4·3H_2O、0.08mol/L，KH_2PO_4、0.02mol/L。适宜的培养条件为：培养基起始pH值8.0、装液量100mL、接种量5%、培养温度37℃，转速,180r/min，工程菌E.coliBL2l(DE3)/pET30a-mpd在此条件下最佳产酶时间为12h，经优化后该菌株产酶活力为7.02U/mL。 对降解酶进行提纯，酶的比活力提高29倍。并对酶性质做了初步研究，得到酶的最佳反应温度30℃最佳pH值8.0，在偏碱性条件下保存，可以常温存放。金属离子Fe2+、Mn2+对酶有强烈的激活作用。用纯化后的酶降解毒死蜱和马拉硫磷，用气相色谱检测，毒死蜱有微量残留，马拉硫磷未检出，说明酶对两种有机磷农药具有很好的降解效果。