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有机磷农药降解酶发酵条件的优化及酶性质的研究

路洪义  
【摘要】:本文对基因工程菌E.coliBL2l(DE3)/pET30a-mpd的发酵条件进行了优化。通过单因素实验考察了培养基中碳源、氮源、磷酸盐的种类和浓度,发酵液初始pH值、接种量、装液量、发酵温度以及乳糖添加量和诱导时间对有机磷农药降解酶的影响,从中得出利于降解酶合成的上述因素的组成为:甘油为碳源、酵母粉和蛋白胨为氮源、初始pH值8.0,接种量5%,装液量100mL/500mL三角瓶,温度25℃,乳糖在发酵后4小时添加。确定了培养基成分和发酵的基本条件。通过Plackett-Burman实验设计法考察了培养基组成和培养条件中的8个因素对降解酶合成的影响,从中筛选出三个影响降解酶产量的关键因素:甘油浓度、发酵温度和乳糖添加量。其它因素的最适条件为:酵母粉15g/L,蛋白胨10g/L,磷酸盐0.08mol/L,接种量5%,装液量100mL/500mL三角瓶,初始pH8.0,乳糖添加时间发酵后4小时。利用响应面分析进一步考察三个重要因素对降解酶合成的影响,通过回归方程得到上述三个条件的最优值分别为:甘油20.8g/L,发酵温度23.4℃,乳糖添加量13.08mmol/L。因此,优化后的最佳培养基组成和培养条件为:酵母粉15g/L,蛋白胨15g/L K_2HPO_4·3H_2O、0.08mol/L,KH_2PO_4、0.02mol/L。适宜的培养条件为:培养基起始pH值8.0、装液量100mL、接种量5%、培养温度37℃,转速,180r/min,工程菌E.coliBL2l(DE3)/pET30a-mpd在此条件下最佳产酶时间为12h,经优化后该菌株产酶活力为7.02U/mL。 对降解酶进行提纯,酶的比活力提高29倍。并对酶性质做了初步研究,得到酶的最佳反应温度30℃最佳pH值8.0,在偏碱性条件下保存,可以常温存放。金属离子Fe2+、Mn2+对酶有强烈的激活作用。用纯化后的酶降解毒死蜱和马拉硫磷,用气相色谱检测,毒死蜱有微量残留,马拉硫磷未检出,说明酶对两种有机磷农药具有很好的降解效果。


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