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玉米赤霉烯酮降解酶基因表达的启动子优化研究

周艳敬  
【摘要】:玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种由镰刀菌产生的真菌毒素,它广泛污染小麦、玉米、高粱等谷物及其制品,具有雌激素作用,主要作用于生殖系统,严重危害人畜健康和生命安全。在前期研究中,本实验室已构建了ZEN降解酶基因ZLHY6由强启动子P43介导的表达载体,并获得了该基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的早期外分泌表达重组子Z1。本课题对工程菌Z1进行了启动子优化,并比较了优化前后启动子调控的表达水平及降解酶活性,得到的主要研究结果如下:1.利用生物信息学方法分析并合成了PlapS启动子片段,将该片段与启动子P43定向替换,构建了表达载体pWBZ7,经过分子生物学鉴定,得到了PlapS启动子介导的早期外分泌表达重组子Z7。2.通过对ZEN降解酶基因ZLHY6的表达水平及降解酶活性的比较,评价了两种组成型启动子P43与PlapS的调控表达效果。将启动子P43与PlapS分别对应的Z1和Z7工程菌在相同条件下发酵培养,并在不同时间取样测定ZEN降解酶活性。结果表明,在发酵10 h-35 h过程中,Z7的降解酶活性较Z1均有明显提高,而且都在12 h达到最高值,分别为219.02 U·mL-1和99.6 U·mL-1。工程菌Z1、Z7样品发酵液的SDS-PAGE和Western Blot分析结果与酶活结果一致;对重组质粒的稳定性分析表明,启动子PlapS介导的ZEN降解酶基因表达载体pWBZ7可以在Bs 168中稳定遗传。3.初步评价了Z7对玉米副产物中ZEN的降解效果。在最适酶活条件下,工程菌Z7的降解酶发酵液处理玉米醪、DDGS 12 h后,上述样品中ZEN的降解率达到90%以上,并完成了降解酶对玉米醪和DDGS中ZEN的脱毒工艺的初步研究。利用20 L发酵罐对Z7进行放大发酵,通过批次实验,获得了使酶高效分泌表达的技术参数,为后续工业化应用提供技术支撑。


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