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小麦中真菌细胞壁水解酶的表达及其对黄曲霉生长及产毒的影响

张伟绩  
【摘要】:小麦在储藏过程中极易被黄曲霉等储粮真菌污染,造成小麦品质的破坏和损失。黄曲霉在繁殖过程中产生的代谢产物黄曲霉毒素在粮食中的积累也极易引起食品安全问题,因此研究小麦储藏过程中黄曲霉的生长和产毒具有重要意义。本研究提取了扬麦15的全基因组,利用PCR技术对其属于病程相关蛋白的真菌细胞壁水解酶β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和内切-1,4-β-甘露聚糖酶基因进行了扩增并得到了长度分别为924 bp、894 bp和1203 bp的编码序列。与载体pGAPZαA和pPIC9K连接后转入毕赤酵母X-33和GS115中分别进行组成型表达和诱导型表达,并对它们的酶学性质和抗真菌特性进行了研究。重组β-1,3-葡聚糖酶的分子量约为33 kDa。β-1,3-葡聚糖酶在pH 6.5时表现出最佳活性,在pH 5.5-8.0之间具有较高活性;β-1,3-葡聚糖酶的最适温度为50℃,经50℃热处理1 h后仍保留约84%的催化活性。测定了β-1,3-葡聚糖酶对昆布多糖的稳态动力学参数,其K_m值和V_(max)值分别为1.32±0.20 mg/mL与96.4±4.4 U/mg。在pH 6.5和50℃的反应条件下,β-1,3-葡聚糖酶对昆布多糖的比活力为13.6 U/mg。重组几丁质酶的分子量约为36 kDa,推断由于糖基化而比预测的分子量大。几丁质酶在pH 5.5时表现出最佳活性。几丁质酶的最适温度为45℃,经50℃热处理30 min后仍保留约93%的催化活性。在pH 5.5和45℃的反应条件下,几丁质酶对胶体几丁质的比活力为29.5 U/mg。几丁质酶的三维结构模拟结果表明,几丁质酶N-端含有结合区域,C-端含有催化区域。重组去结合域的几丁质酶的分子量约为26 kDa。最适pH为5.0,最适温度为45℃。经50℃热处理30 min后保留约61%的活性。在最适反应条件下,去结合域的几丁质酶对胶体几丁质的比活力为18.61 U/mg。重组内切-1,4-β-甘露聚糖酶的分子量约为43 kDa,在pH 4.0和45℃时表现出最佳活性,经45℃热处理30 min后仍保留约86%的催化活性。经4℃pH 4.0-9.0保存1 h后仍保留超过80%的催化活性。在pH 4.0和45℃的反应条件下,内切-1,4-β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的比活力为12.13 U/mg。内切-1,4-β-甘露聚糖酶对底物魔芋葡甘露聚糖的主要水解产物为甘露二糖,对半乳甘露聚糖水解产物主要为甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖。水解24 h后还原糖产生量分别为33μg/mL和13μg/mL。对重组菌Glu-GS115,Chi-GS115和Man-GS115进行了摇瓶优化。结果表明,重组菌株的最佳甲醇诱导浓度为分别为1%,2%和1.5%。最佳诱导时间分别为96 h,120h和72 h。体外抑菌试验分析了纯化的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和内切-1,4-β-甘露聚糖酶对小麦籽粒中七种常见真菌的抑菌效果。三种真菌细胞壁水解酶对禾谷镰刀菌、链格孢霉、灰绿曲霉、黄曲霉、黑曲霉和青霉的菌丝生长均有不同程度的抑制作用,对真菌的孢子形成和菌丝形态影响较显著影响。不同浓度的真菌细胞壁水解酶对黄曲霉的孢子萌发和菌丝生长有不同的影响。培养基中的β-1,3-葡聚糖酶浓度达到104μg/mL时,菌落直径减小19.35%,外围菌丝生长和孢子萌发受到略微抑制。几丁质酶浓度达到116μg/mL时,菌落直径减小16%,菌丝生长更茂盛,孢子萌发受到完全抑制。内切-1,4-β-甘露聚糖酶达到111μg/mL时,菌落直径增加了16%,菌丝生长更茂盛,孢子萌发受到完全抑制。β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和内切-1,4-β-甘露聚糖酶对黄曲霉产AFB_1的抑制率分别为33.27%,67.56%和33.17%。


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