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黄曲霉毒素的时间分辨荧光高灵敏免疫检测技术

王坤  
【摘要】:黄曲霉毒素B_1(AFB_1)是由真菌的部分产毒菌株产生的次级代谢产物,广泛存在于各类食品中,在自然界分布也很广泛,它的毒性是最强的。黄曲霉毒素B_1是主要对人类和动物的肝脏、肾脏的能够产生强毒和强致癌,AFB_1主要污染玉米、大豆、饲料等,进入到人和动物体内,它会引起人和动物的很多病变,甚至死亡。世界卫生组织的癌症研究机构(International Agency for Research onCancer, IARC)划定为I类致癌物。要从各个方面严格控制AFB_1对人类食品和动物饲料产生污染,将AFB_1的危害降到最低,开发新的高灵敏的检测AFB_1的方法尤为重要。随着技术的不断发展,时间分辨荧光免疫分析方法(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)得到了快速的发展,它具有没有放射性污染、检测灵敏度高、试验操作简便、重复性好等多种优点,另外TRFIA能够满足大量样品的检测。本研究通过分析AFB_1的结构特点,先制备出人工抗原,再通过采集小鼠腹水的方法制备并纯化得到单克隆抗体,成功制备出AFB_1间接竞争TRFIA试剂盒并对其性能进行了评价,确立了常见样品的快速处理方法,为AFB_1快速检测试剂盒的应用及推广打下了基础。 采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide NHS)法和碳二亚氨法(EDC)将AFB_1偶联于载体蛋白BSA上,合成人工抗原AFB_1-BSA。并利用紫外扫描法(UV)、SDS-PAGE凝胶电泳试验及单克隆抗体等手段对人工抗原进行了初步鉴定,结果显示:人工抗原的紫外吸收峰包含AFB_1及蛋白载体的紫外扫描特征峰,且在此基础上出现了偏移;其分子量较载体蛋白也有所增加;具有良好的免疫原性,从而充分说明了AFB_1人工抗原制备成功。 采用稀土离子标记技术,应用单克隆抗体建立高灵敏的黄曲霉毒素Bl(AFB_1)时间分辨荧光免疫分析法(AFB_1-TRFIA)。以AFB_1-BSA为免疫原制备抗AFB_1抗体;AFB_1与BSA的联结物(AFB_1-BSA)为固相抗原,与游离AFB_1共同竞争有限的AFB_1抗体;用Eu~(3+)标记的羊抗鼠抗体作为二抗。该方法的灵敏度为0.0094μg/L,测量范围为0.01-10μg/L,批内和批间的变异率分别为3.05%和4.71%,平均回收率为91.75%,与黄曲霉毒素B_2对AFB_1的检测有5.12%交叉反应,而赭曲霉毒素A等真菌毒素及BSA则没有交叉反应。试验研究表明,AFB_1-TRFIA是目前在AFB_1检测中最灵敏和简便的方法之一,该分析方法具有稳定性好、可测范围宽,具有很好的应用前景。


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