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动物性食品中玉米赤霉醇ELISA快速检测方法的研究

邓歌  
【摘要】:近年来,真菌毒素对食品的污染越来越严重,其中因玉米赤霉醇(ZER)所造成的污染已不容忽视。玉米赤霉醇及其代谢产物具有一定的雌激素作用,它随食物链进入机体后,会造成机体生长发育障碍,对机体第二性征产生影响。我国农业部早在2002年就明确禁止玉米赤霉醇作为增重剂用于畜禽养殖。目前,用于食品及饲料中ZER的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和免疫分析技术。薄层色谱法只能用于定性分析;高效液相色谱法的前处理过程复杂,需要专业人员操作,应用大量的有毒有机溶剂,使其应用受到一定的限制。而ELISA免疫分析技术具有快速、灵敏、简便、特异等优点,正好可以弥补上述方法的不足,已被成功运用于食品和饲料中真菌毒素的快速检测。1、玉米赤霉醇人工抗原的合成及多抗血清的制备针对ZER第十六位上的羟基进行改造,设计并合成半抗原ZER-16-羧丙基丁醚。分别采用混合酸酐法和碳二亚胺(EDC)法将改造后的半抗原与载体蛋白BSA和OVA偶联,制备出人工免疫抗原ZER-BSA和人工检测抗原ZER-OVA。经SDS-PAGE电泳鉴定,偶联蛋白在凝胶上的迁移距离比载体蛋白小,故偶联成功。之后免疫小鼠并成功制备出效价达1:2.56×104、IC50为15.77ng/m L的鼠源多抗血清。2、玉米赤霉醇单克隆抗体的制备及其特性鉴定成功获得高效ZER多抗血清后,采用单克隆抗体技术和细胞融合技术将有效小鼠的脾细胞与SP/20骨髓瘤细胞进行融合,多次亚克隆后筛选出了三株能够稳定分泌ZERm Ab的杂交瘤细胞株,分别为6B2E6、6B2E11和12B10A7,其细胞上清效价可达1:2.56×104、1:5.12×104和1:2.56×104。将敏感性最好的12B10A7细胞株注射到处理过的小鼠腹腔内,收集到的腹水效价为1:6.4×105。所得单抗经鉴定为Ig G1型,亲和常数Ka为4.7×1011L/mol,回归方程为y=-0.3796x+0.7746,相关系数R2=0.9885,IC50=0.529ng/m L。ZERm Ab与黄曲霉毒素B1(AFB1)、伏马菌素B1(FB1)等非同类毒素的交叉反应率低,均小于0.5%。该细胞株不论是体外传代还是冻存复苏后都能稳定地分泌抗体。3、ZER间接竞争ELISA检测分析法的建立及在动物性食品中ZER残留检测的应用通过反复的ELISA检测试验,确定了抗原最佳包被浓度为1:2000倍稀释,抗体最佳工作浓度在1:10000倍稀释,建立了ZER间接竞争ELISA检测方法,用此方法对动物性食品中ZER残留进行检测,回归方程为y=-0.3582x+0.5949,相关系数R2=0.9925,IC50=0.184ng/m L。回收率在85%以上,变异系数小于10%,试验结果表明本试验建立的ZER间接竞争ELISA检测分析法灵敏性强,准确率高,能够有效地检测食品中ZER的残留。


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