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猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究

顾帅  
【摘要】:猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起妊娠母猪繁殖障碍的主要病原体之一。该病广泛存在于世界各地并在大多数种猪场流行,严重影响着养猪业的发展。本研究从河南数个发生母猪繁殖障碍猪场采集的流产、死胎病料中分离到4株病毒,这些毒株均能在PK-15细胞中增殖,引起细胞病变(CPE),能凝集0.6%的豚鼠红细胞(RBC)并能被猪细小病毒阳性血清所中和,间接免疫荧光检测感染细胞进行可见特异的绿色荧光信号对。利用PCR方法扩增部分ns 1基因并与GenBank其他猪细小病毒序列比较,同源性高达98%以上。最终将这些分离物鉴定为猪细小病毒,并分别命名为HNZK-1株、HNZK-2株、HNAY株、HNLH株。通过设计涵盖猪细小病毒全基因组的3对特异性引物,分段克隆猪细小病毒的基因组片段,对猪细小病毒HNZK-1株和HNAY株进行了全基因组序列测定。结果表明HNZK-1株和HNAY株基因组全长分别为4668nt和4610nt,其编码区均不存在碱基的插入与缺失,但在vp 2终止密码子处的非编码区存在不同程度的碱基缺失,与NADL-2株相比分别缺少15nt和69nt。ns l基因及编码蛋白的多序列比对表明HNZK-1株和HNAY株与Nanjing200802株同源性最高。vp 2基因及编码蛋白的多序列比对表明HNZK-1株和HNAY株与Nanjing 200801株同源性最高。遗传进化分析表明,我国的猪细小病毒流行毒株在进化树上比较接近。通过对HNZK-1株生物学特性的初步研究,发现其对乙醚、氯仿、胰酶、pH3.0的酸、56℃热处理等均不敏感,在同步接毒培养时能得到较高的病毒血凝(HA)效价。病毒经甲醛灭活后制成油乳疫苗免疫豚鼠,结果显示其能够诱导豚鼠产生高达2~(10)以上的血凝抑制(HI)抗体,免疫后12周抗体滴度几乎没有下降仍能维持较高的抗体水平。与HNZK-1株猪细小病毒灭活油乳疫苗相比,市售疫苗所够诱导的HI抗体滴度要低2~1~2~2。 根据已经发表的猪细小病毒的vp 2基因序列,设计一对特异性引物,建立了检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。该方法最小检出量为12个拷贝每反应。模板浓度在10~8拷贝范围内10倍比稀释呈良好的线性关系,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒无交叉反应。应用本方法对HNZK-1株猪细小病毒在体外感染细胞后的复制动态进行了研究,并首次绘制了病毒的体外增殖曲线。数据换算成每瓶(25cm~2)中细胞内、外病毒拷贝数,结果显示细胞外病毒量在接毒初始的36h逐渐下降,随后开始逐步增加;接毒后84h培养液中病毒含量(1.739×10~(10)拷贝)逐渐超过细胞内的病毒含量(1.321×10~(10)拷贝)。在接毒后108小时培养液中病毒含量达到最高点(7.626×10~(10)拷贝),随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后24h内为一对数增长期,然后为一缓慢增长期。至接种后72h达到复制最高点(1.425×10~(10)拷贝),接毒后84h略有降低(1.321×10~(10)拷贝),并维持至接毒后108h。与病毒复制动态变化相对应的细胞病变是从细胞聚集、开始形成蚀斑到约80%的细胞病变产生。108h之后随着细胞的大量死亡,细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。 参考GenBank所公布的猪细小病毒核苷酸序列,设计了一对特异性引物,扩增了HNAY株猪细小病毒的vp 2主要抗原基因,将其克隆至pMD18-T载体,测序获得873bp核苷酸序列。将其经酶切后克隆于pET-32a(+)表达载体,构建了重组表达载体pET-vp2,将阳性重组质粒转化进BL21(D3)宿主菌中,经IPTG诱导使重组蛋白获得高效表达,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和Western分析表明该重组蛋白相对分子量约为49 KDa。


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