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猕猴桃、枣高效再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化研究

尚霄丽  
【摘要】:猕猴桃(Actinidia)果实风味独特,营养丰富,被誉为“水果之王”。枣(Zizyphus jujuba Mill.)是我国第一大干果树种。猕猴桃属雌雄异株,遗传背景复杂;枣花蕾小、自然坐果率低、胚败育率高等因素,传统杂交育种方法存在周期长、效率低等问题,获得优质多抗的猕猴桃、枣新品种困难重重。基因工程的发展为猕猴桃、枣的育种工作开辟了一条新的途径。 本研究以河南特异红果肉猕猴桃资源中华猕猴桃‘伏牛95-2’(Actinidia chinensis'Funiu95-2')为材料,建立了中华猕猴桃‘伏牛95-2’高效再生体系、遗传转化体系,且获得了转抗菌肽D基因的转基因植株,PCR检测、Southern杂交检测证明外源基因已整合到猕猴桃基因组中。灰枣遗传转化研究,本试验以灰枣(Zizyphus jujuba 'Huizao')为材料建立了灰枣组培快繁体系、叶片直接再生体系及对灰枣遗传转化进行了初步探讨。主要结果如下: 1.以中华猕猴桃‘伏牛95-2’叶片为外植体,探讨了不同植物生长调节物质对叶片再生不定芽增殖及生根的影响,建立了高效的再生体系。结果表明,叶片外植体在MS+ZT1.0mg/L+ NAA 0.3mg/L培养基上,不定芽分化率最高为87.5%;在MS+ 6-BA 2.0 mg/L+NAA0.5mg/L培养基中,不定芽增殖系数最高为4.2;适宜不定芽生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L,生根率为100%。 2.以中华猕猴桃‘伏牛95-2’叶片为外植体,研究了抗生素对外植体生长的影响。结果表明,中华猕猴桃‘伏牛95-2’对卡那霉素较敏感,浓度20mg/L时愈伤组织及不定芽分化率均为0,20mg/L为中华猕猴桃‘伏牛95-2’叶片遗传转化时筛选最佳浓度;生根培养基中附加30mg/L卡那霉素时,则完全抑制根的形成。头孢霉素和羧苄青霉素对中华猕猴桃‘伏牛95-2’叶片分化均有抑制作用,但头孢霉素对叶片分化的抑制作用比羧苄青霉素小;结合遗传转化中的抑菌试验,选用400mg/L头孢霉素为中华猕猴桃‘伏牛95-2’遗传转化中适宜抑菌抗生素及浓度。 3.以中华猕猴桃‘伏牛95-2’叶片作为根癌农杆菌介导的受体材料,建立了高效遗传转化体系。结果表明,叶片预培养3天,菌液浓度OD600值为0.3,真空渗入方式侵染10 min,共培养4天条件下,GUS基因瞬时表达率最高,达到92.2%。对转基因抗性植株进行PCR检测和GUS组织化学染色,初步证明外源基因已整合到中华猕猴桃‘伏牛95-2’的基因组中。 4.以中华猕猴桃‘伏牛95-2’叶片为外植体进行遗传转化,对共培养后抗性芽的筛选方式进行了研究,并对获得的转抗菌肽D基因的抗性植株进行了分子生物检测。结果表明,逐步提高卡那霉素选择压力与保持卡那霉素选择压力不变相比,抗性芽获得率提高了28.4%;部分抗性植株经PCR、PCR-Southern、Southern杂交检测,外源基因已整合至猕猴桃基因组中。 5.以灰枣一年生枣头茎段为材料,对启动培养时抗生素对污染的抑制,不同植物生长调节物质对茎段启动、不定芽增殖及生根的影响进行了研究。结果表明,大田采样时,以70%酒精灭菌30s,再以0.1%HgCl2灭菌10~15min后污染率依然高达97.8%;培养基中添加150mg/L或200mg/L头孢霉素可使污染率降为0;茎段接种于MS+KT 2.0 mg/L+NAAO.lmg/L培养基中获得的粗壮枣头较多。茎段萌发的腋芽接种于Ms+KT2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L培养基中,枣苗长势壮、叶片大、叶深绿;而接种于Ms+6-BA2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L培养基中,组培苗较弱,增殖系数较高为2.7。将继代增殖的再生芽接种在生根培养基上诱导生根,最佳的生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L,培养40d时生根率达95.56%。 6.以灰枣组培苗叶片为材料,研究了不同叶片来源、碳源、叶片放置方式、暗培养时间、乙烯抑制剂等处理对叶片再生的影响。结果表明,叶片直接再生不定芽的适宜培养基为WPM +TDZ 0.5mg/L+NAA0.2mg/L;最佳叶片来源为灰枣组培苗中部平展,大而厚叶片;近叶柄处再生率比近叶尖处高59.74%;以远轴面接触培养基叶片再生率较高为69.61%;蔗糖浓度为40g/L可降低再生芽的玻璃化程度;叶片暗培养时间以10d叶片再生率较高为81.6%;0.5mg/L AgNO3和0.1 mg/L的STS均提高了灰枣叶片再生率,再生率分别为82.25%,91.26%。 7.以灰枣叶片为受体,研究了卡那霉素对叶片再生的影响、头孢霉素的抑菌效果及不同共培养时间对转化率的影响。结果表明,当灰枣叶片再生培养基中添加40mg/L卡那霉素能抑制不定芽的分化,40mg/L为灰枣遗传转化中的临界浓度;不同头孢霉素抑菌浓度效果差异明显,高浓度的头孢(大于等于500mg/L)才能抑制农杆菌的生长;灰枣遗传转化中,共培养时间应较短2d能获得较高转化率21.1%;对获得的灰枣转化植株叶片进行组织化学染色分析发现,叶片叶脉为蓝色,初步确定外源基因已转入灰枣基因组中。


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