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昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究

任卫青  
【摘要】:目前,已建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,昆明小鼠作为我国科研工作中常用的实验动物,其建系的报道较少,因此建立昆明小鼠胚胎干细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其它生命科学领域的研究具有重要意义。SC1是一种小分子化学物,可以双重抑制Ras-GAP和ERK1,维持胚胎干细胞未分化状态。另外,近几年,已有多篇关于胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs),并进一步生成成熟配子的报道,但ES细胞向生殖细胞的诱导效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作为试验对象,比较了不同培养条件对昆明小鼠ES细胞分离培养的影响,研究了小分子化学物(Pluripotin,SC1)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并用视黄酸(Retinoic acid,RA)对分离到的ES细胞向PGCs诱导分化进行了初步研究,为昆明小鼠ES细胞建系及向生殖细胞的体外分化研究提供参考。 1.利用MTT法检测丝裂霉素C(10μg/mL)处理不同时间后小鼠胎儿成纤维细胞(Mouseembryonic fibroblast, MEF)活力变化情况。结果表明,以3代以内MEF制备饲养层,用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理2~2.5h,MEF活力最稳定,可以维持小鼠胎儿成纤维细胞7d以上不增殖也不死亡,是制备饲养层的适宜条件。 2.将见栓后3.5~4d的胚胎分别接种于密度为1×104、1×105、1×106/mL的饲养层上,比较胚胎在不同密度饲养层上贴壁、内细胞团(Inner cell mass,ICM)集落形成及ES细胞的克隆生长情况。同时,以无血清培养基为基础培养液,研究胚胎发育阶段和培养液中添加不同生长因子对昆明小鼠ES细胞增殖的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105/mL的饲养层上,F1代和F2代ES细胞集落出现率均显著高于其他2组(P0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆出现率显著高于桑葚胚(P0.05),培养液中同时添加干细胞因子(Stem cell factor,SCF)和胰岛素的胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞集落出现率显著高于其他2组(P0.05)。对分离的ES细胞进行形态观察、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)染色,免疫荧光染色检测小鼠ES细胞全能性特异标志物的表达,证实所分离的ES细胞符合小鼠ES的一系列特征。由此认为,发育至囊胚的胚胎在饲养层密度为1×105/mL上,培养液中同时添加胰岛素和SCF适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。 3.比较了在含血清替代品(Knockout serum replacement,KSR)的高糖DMEM培养液中(H-DMEM)分别添加SC1和白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度。以MEF为饲养层,以含LIF的无血清胚胎干细胞培养液为对照,分别用浓度为300nM、1μM、3μM的SC1代替LIF对昆明小鼠胚胎进行分离培养。结果显示,胚胎在添加3μmSC1的培养液中ICM集落形成率显著高于对照组(P0.05),形成的ES集落与对照组形态差异不明显,最高传至第7代,并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态。不同浓度SC1培养液中,胚胎在SC1浓度为300nM组的F2代ES细胞集落出现率显著高于1μM和3μM组(P0.05),所分离的ES细胞AKP染色呈阳性,Oct4、Nanog、Sox2的免疫荧光染色均显阳性,具有ES细胞的特点。这一结果表明无血清培养液中SC1可以替代LIF用于昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持,并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养。 4.探讨了RA诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化的能力及适宜浓度。采用悬滴培养法使分离到的第3代ES细胞形成类胚体(Embryonic bodys,EBs),将第3d形成的EBs,接在铺有0.1%明胶的48孔板中,5个EB/孔,分别用浓度为0.2μM、1μM、5μM的RA和不加RA的培养液进行培养。第10d免疫荧光染色的结果表明,浓度为1μM的RA诱导小鼠ES细胞分化为PGCs的效率显著高于其它组(P0.05),SCP3和VASA的阳性率表达率分别是31.8%和30.4%,均高于其它组,表明RA可以诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化,最佳浓度为1μM。


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