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小鼠B6品系自发突变白斑的遗传学研究

王栋  
【摘要】:小鼠有多种毛色,白色(albino)、黑色(black)、鼠灰色(agouti)、黄色(yellow)、白斑(piebeld)等,关于这些毛色多样性的研究已有一个多世纪,事实证明这些毛色多样的小鼠为遗传学和胚胎发育学的发展起到了很大作用,并为一些重大科学发现提供了极有价值的研究工具。白斑突变小鼠由于其表型及突变分子机制与人类某些色素沉着紊乱疾病,比如斑驳病(Piebaldism)、瓦登伯格综合症(Waardenburg Syndrome)等相似,因而成为研究这些疾病的理想实验动物模型。 本实验室白斑突变小鼠为B6遗传背景自发突变,传代试验证实该突变性状稳定且能够遗传。本研究通过交配测试试验确立了该突变性状的遗传模式,并对突变纯合子进行筛选和观察,同时对突变基因进行了定位,确定了候选基因kit,通过对kit基因克隆测序找到了碱基突变位点,从而成功从分子水平上鉴定了白斑突变发生机制,加深了对该突变小鼠的认识,为kit基因及人类斑驳病的研究提供了一种新的材料。本论文由以下几部分组成: 1、白斑突变遗传模式的确立 白斑突变杂合子与正常表型B6小鼠交配,获得G1代小鼠146只,通过统计G1代小鼠中突变型与正常型小鼠数目,并将其与单基因染色体遗传模式理论值进行卡方检验,最终确定突变性状的遗传模式为单基因染色体遗传。 2、白斑突变纯合子筛选和观察 白斑突变杂合子互交繁殖,获得16胎后代,共72只小鼠。在这些子代小鼠中除了正常B6小鼠黑色毛色表型和突变杂合子白斑表型外,未出现新表型或白斑区域显著扩大的表型。通过交配试验证实这些后代小鼠无纯合子,推测纯合子因突变基因纯合致死,观察并初步确定是在出生后1-2日龄因贫血死亡。 3、白斑突变基因的定位克隆 选用﹛(B6×PWK)F1×PWK﹜N_2小鼠60只,提取每只小鼠DNA,逐个用38对微卫星引物扩增,分析微卫星标记与突变表型间的关系(连锁或重组),并通过计算“优势对数值(LODS)”方法将突变基因定位于小鼠第五号染色体上。繁殖扩大N_2样本数量216只,选择第5号染色体42cM附近两个微卫星标记D5Mit304(41.0cM)和D5Mit359(44.0cM)进行精细定位,通过计算各微卫星标记与突变基因的重组率,根据三点测试原理将白斑突变基因定位于D5Mit304和D5Mit359之间42.20cM。对定位部位及定位置信区间内的基因逐个进行功能分析,确定候选基因kit,通过对其cDNA克隆测序,结果显示突变白斑小鼠kit基因cDNA序列第2576位碱基由G→A,导致kit基因编码区第822位密码子由GGG→AGG,甘氨酸(G)变为精氨酸(R)。


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