肠球菌新型座子的鉴定及功能分析

【摘要】：近年来,由于抗生素的频繁使用,多药耐药肠球菌的出现逐渐增多,肠球菌现已发展成为院内感染的主要病原菌之一。其中,转座子在多药耐药肠球菌的形成中发挥着重要作用。转座子是一种可移动的遗传元件,可携带耐药基因甚至毒力基因的移动,从而造成病原菌的耐药性、致病性的水平转移和快速传播,加速了病原菌的适应性进化。因此,研究肠球菌转座子介导的耐药基因水平转移具有重要的临床意义。本研究在已分离鉴定的86株人源、猪源肠球菌的基础上,进行肠球菌杆菌肽锌耐药基因bcrB、四环素耐药基因tet(M)的检测,质粒接合及电转化试验、S1-PFGE、Southern杂交、全基因组测序等,来探讨杆菌肽锌耐药基因bcrB、四环素耐药基因tet(M)与转座子的关系。结果显示,杆菌肽锌耐药基因bcrB在猪源和人源肠球菌中均能检出,其阳性率分别为(47.4%,27/57)和(13.8%,4/29)。与人源肠球菌检出率相比,猪源肠球菌检出率较高,这可能是由于杆菌肽锌在养猪业中长期作为饲料添加剂使用有关。接合试验表明,bcrB基因可以发生接合转移,其在人源和猪源菌株中的接合效率分别为(4.5±0.3)×10-3和(6.0±0.5)×10-5。MLST分型显示,大部分猪源、人源bcrB阳性肠球菌分属不同的ST型,但也检测到1株人源肠球菌H9和1株猪源肠球菌P33同属ST116型,携带bcrB的肠球菌能否发生跨种传播值得关注。bcrB的遗传环境分析表明,其位于一个含有两端同向重复序列ISEnfa1形成的新型复合转座子上,该复合转座子完全插入在zeta基因上,其靶序列是TTAGGAA。bcrB的定位表明,其位于一个约56.5Kb的质粒上,该质粒同时含有两个多药耐药基因簇,分别为erm(B)-aadE-spw-lsa(E)-lnu(B)和aadE-sat4-aphA3,其中erm(B)-aadE-spw-lsa(E)-lnu(B)耐药基因簇可编码对大环内酯类、氨基糖苷类、街短侧耳素类、链阳霉素类及林可霉素的耐药,系首次在肠球菌中检测;aadE-sat4-aphA3耐药基因簇可编码对氨基糖苷类药物耐药,先后在肠球菌、葡萄球菌、甚至在弯曲杆菌中检测到。bcrB基因与多药耐药基因簇erm(B)-aadE-spw-lsa(E)-lnu(B)和aadE-sat4-aphA3共同位于一个多药耐药质粒上,将显著有助于该质粒的维持和扩散,从而加速了耐药性的传播。四环素耐药基因tet(M)在猪源肠球菌中的检测率为21%(12/57)。接合试验表明,tet(M)基因可发生接合转移,其在屎、粪肠球菌中的接合效率为分别为3.5×10-5、5.0×10-7。tet(M)-tnd X扩增获得一个比预期大5.2Kb的片段,进一步的全基因组测序获得一个23.9kb的新型接合型转座子,命名为Tn6247。该转座子与Tn5397相比,在耐药区插入了一个5.2kb的片段,含有tetL-pre/mob-repU-IS1216E,但在orf14处缺少了intron Ⅱ片段。Tn6247完全插入在肠球菌的fic基因上,其靶序列是GAAGGAAATG。野生菌株的S1-PFGE及Southern杂交试验显示,Tn6247位于一个大于194kb的“巨型”质粒上,推测Tn6247可随质粒进行接合转移。综上所述,本研究鉴定了一个新型接合转座子,Tn6247;和一个新型杆菌肽锌耐药复合转座子,且位于多重耐药质粒上。新型转座子及多重耐药质粒的鉴定及功能分析,为肠球菌多药耐药的快速出现提供了部分的理论解释和依据。