不同来源肠球菌新型Tn916型接合转座子的鉴定和功能分析

【摘要】：随着抗生素在兽医临床中的广泛使用,细菌的耐药性越来越严重,特别是一些耐药基因的水平或垂直传播给临床治疗带来很大的困难。而肠球菌一直以来被很多学着认为是多种耐药基因的贮存库,目前已发现多种耐药基因(四环素耐药基因tet(M)、红霉素耐药基因ermB和庆大霉素耐药基因aac-aphD等)均可通过肠球菌水平传播。四环素是目前常用的广谱类抗生素,其耐药性较为严重,耐药机制也较为复杂,如外排泵蛋白tet(L)、tet(K)和核糖体保护蛋白tet(M)、tet(O)等,其中tet(M)在细菌中较为常见,主要原因为tet(M)常常被Tn916-Tn1545家族转座子所携带,在革兰氏阳性菌和阴性菌中转移。一旦肠球菌获得四环素耐药基因,将在四环素耐药性传播中发挥重要作用,因此对肠球菌耐药性传播机制的研究尤为重要。本研究首先分离得到413株禽源、猪源和人源肠球菌,在此基础上进行含有四环素耐药基因tet(M)和Tn916中tet(M)-int的扩增,在此过程中发现有部分菌株tet(M)-int相比Tn916较长,通过选取2株进行全基因组测序发现四环素耐药基因tet(M)-tet(L)连锁现象以及与氯霉素耐药基因cat的连锁,随后进行overlappingPCR、细菌接合试验、环状中间体扩增等进一步研究其全序列、流行情况以及转座子的功能分析。结果显示,在分离鉴定的3种不同来源的肠球菌中都检测到了四环素耐药基因tet(M)-tet(L)和四环素氯霉素耐药基因相连的tet(M)-tet(L)-cat的菌株,部分和转座酶int相连,通过overlapping PCR获得分别获得了大小为21.9Kb和25.3Kb的Tn916型转座子,分别命名为Tn6258和Tn6259。其中Tn6258和Tn6259在禽源、猪源和人源肠球菌中的检测率分别为11.5%、7.3%、7.2%和2%、6.4%、0.09%。接合试验显示Tn6258和Tn6259均可发生接合,Tn6258在禽源、猪源和人源肠球菌中都筛选出接合子,而Tn6259仅在猪源和人源肠球菌中发生接合,本实验在禽源中未得到接合子。随后分别对两种不同的转座子设计反向PCR扩增其环状中间体,结果表明转座子Tn6258和Tn6259均可发生环化。接合试验和环化试验表明新型接合转座子可以携带其耐药基因进行水平转移。综上所述,在不同来源的肠球菌中都有Tn916-like新型接合转座子的发现。与Tn916相比,Tn6258新整合了四环素耐药基因tet(L);而Tn6259不仅整合了四环素耐药基因tet(L),还整合了氯霉素耐药基因cat。进一步接合试验表明,两个新型转座子均可通过接合转座方式水平传播耐药基因,增加了治疗的难度,对临床耐药性传播迅速提供一些理论依据。