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农杆菌介导‘蜂蜜罐’枣上胚轴和子叶遗传转化体系的建立及Bt基因的转化

王腾飞  
【摘要】:枣树是我国重要的经济树种之一,具有抗旱、耐瘠薄、适应性强等特点,并且枣树果实营养丰富,深受大众喜爱。枣树杂交育种由于工作量大、育种周期长,极大地限制了枣树的栽培发展,与此同时,枣尺蠖、枣粘虫、枣桃小食心虫、黄刺蛾等常见害虫也极大地制约了枣树的生产栽培。枣树虫害研究的需求,随着枣树种植面积的一步步扩大,枣树虫害一步步地蔓延和加重,也在慢慢地扩大和延伸。现代分子生物技术,尤其是植物组织培养和基因工程的发展,为枣树定向改良和新品种选育提供了重要的技术支持;而转基因技术的出现为快速培育枣树抗虫新种质提供了可能。本试验以‘蜂蜜罐’枣胚培苗上胚轴和子叶为试验材料,进行根癌农杆菌介导的遗传转化,通过比较不同处理的GUS瞬时表达率,研究了不同的预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和侵染方式对转化效率的影响,优化了农杆菌介导上胚轴和子叶的遗传转化体系;在此基础上,以‘蜂蜜罐’枣上胚轴、子叶和叶片为外植体,利用农杆菌介导法进行Bt基因的转化研究,为遗传转化培育抗虫新种质奠定了基础。主要研究结果如下:1.不同外植体Kan敏感性试验以上胚轴和子叶为外植体,探究了不同浓度Kan对愈伤组织形成和不定芽再生的影响。结果表明,50 mg/L Kan为抑制上胚轴和子叶再生的最适浓度。2.上胚轴和子叶遗传转化体系的建立通过比较GUS瞬时表达率,确定了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和侵染方式的最适处理。结果表明,以上胚轴为外植体时,菌液浓度OD600为0.5,采用真空辅助侵染10 min,共培养培养基添加20 mg/L乙酰丁香酮,共培养3 d后GUS瞬时表达率最高,为最佳转化体系;以子叶为外植体,预培养3 d,菌液浓度OD600为0.5,采用真空辅助侵染10 min,共培养培养基添加10 mg/L乙酰丁香酮,共培养3 d后GUS瞬时表达率最高,为最佳遗传转化体系。3.农杆菌介导‘蜂蜜罐’枣不同外植体Bt基因的转化分别以上胚轴、子叶和叶片为外植体,通过农杆菌介导Bt基因遗传转化,对三种外植体获得的抗性芽进行PCR检测,共获得21株经PCR检测为阳性的植株,并对三种外植体的转化率进行了比较。


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