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猕猴桃叶片再生体系的建立和转抗菌肽D基因对保护酶活性的影响

韦鹏飞  
【摘要】:猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)是世界上一种重要的水果,该属有54个种,21个变种,共约75个分类单元,其中中华猕猴桃(A.chinensis Planch.var.chinensis,果肉绿色)和美味猕猴桃(A.chinensis var.deliciosa,果肉金黄色)是栽培最广泛的的两个商业种类。而软枣猕猴桃(Actinidia arguta Planch)目前仅有零星栽培,因其果面无毛,风味独特,是一种具有发展前景的果树资源。其中‘天源红’软枣猕猴桃果皮、果肉和果心全为红色,酸甜适口,光洁无毛,可带皮直接食用,具有重要推广经济价值。为了建立‘天源红’软枣猕猴桃快繁体系,本试验以组培苗叶片及茎尖为材料,探讨了植物生长调节剂对叶片愈伤再生的影响。猕猴桃细菌性溃疡病,是一种毁灭性细菌病害,对世界猕猴桃产业的发展造成了严重的威胁。目前尚无有效方法抑制猕猴桃溃疡病害的发生,而采取基因工程技术培育抗病性强的品种是避免溃疡病带来损失的有效方法之一。本研究以转抗菌肽D的中华猕猴桃为材料,诱导生根和移栽获得了大量的猕猴桃盆栽苗,通过喷施猕猴桃细菌性溃疡病病原菌,分析猕猴桃喷施菌液前后相关酶活性的变化,预测转基因植株的抗病性变化。主要研究结果如下:(1)不同浓度的6-BA和NAA对‘天源红’软枣猕猴桃茎段增殖的影响分析结果表明,茎段增殖倍数随着6-BA的浓度增加而增大,在6-BA浓度为3.0 mg/L,NAA浓度为0.5 mg/L时,茎段增殖倍数达到最大,为3.29±0.03。(2)不同浓度的ZT和6-BA对叶片形成愈伤的结果表明,6-BA和ZT对愈伤形成的影响有很大的不同。6-BA浓度从0.5 mg/L到3.0 mg/L,叶片均不能形成愈伤组织,褐化率高,而ZT能明显诱导愈伤组织的形成,且褐化率较低。(3)不同浓度的ZT和IAA对叶片再生率的影响结果表明,当ZT浓度为2.5 mg/L,IAA浓度为0.5 mg/L时,叶片再生率达到最高,为45.00%。(4)不同时间的暗培养对叶片再生率的影响。以MS+ZT 2.5mg/L+IAA 0.5 mg/L为基本培养基,分别进行15 d,20 d,25 d,30 d的暗处理,结果表明,当叶片进行30d的暗处理,叶片再生率最高,为81.67%。(5)以转抗菌肽D的中华猕猴桃抗性芽为材料,通过诱导生根处理和移栽获得了大量的猕猴桃盆栽苗,生根结果显示,使用1.0 g/L的IBA处理15 s生根效果最好,形成的愈伤较少,且根系较多。(6)转基因猕猴桃的PCR和RT-PCR检测结果表明,外源抗菌肽D基因已经整合到猕猴桃基因组中,并在猕猴桃基因组中进行转录,且不同株系间的外源基因的表达量有差异。(7)对喷施菌液前后猕猴桃苗叶片中的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性分析结果表明,转抗菌肽D基因在猕猴桃基因组中的过量表达对猕猴桃叶片CAT、POD、PAL活性变化影响不明显。但是在喷施病原微生物(菌液浓度为1.2×107~108,OD值为0.2左右)的条件下,转基因植株的CAT和POD活性比对照植株明显降低,PAL活性比对照植株明显升高。


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