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枣黑斑病菌SSN3、SSN8、MED12和MED13基因功能初步研究

张亚龙  
【摘要】:枣树是中国第一大干果树种,也是重要的药用和经济林作物。真菌病害严重影响了枣产量与品质,其中链格孢(Alternaria alternata)是引起枣果实病害的重要病原,能够导致多种症状,如枣黑斑、枣褐皮、枣缩果等我们以其典型代表症状将该病害命名为枣黑斑病。2015年,链格孢(A.alternata)全基因组数据的公布,为其基因功能的定点研究、互作机制、致病机理等的研究奠定了基础。本文采用重叠PCR技术,利用原生质体转化的方法,将目的基因替换为潮霉素抗性基因hyg,敲除了枣黑斑病菌中编码CDK8激酶模块的SSN3、SSN8、MED12和MED13这四个蛋白的基因,通过报告基因表达的抗性筛选及PCR检测,分别获得了这四个蛋白编码基因的缺失突变体,同时还得到了这四个编码基因缺失突变体的回补菌株。通过对以上缺失突变体及其回补菌株的表型分析发现:1)Ssn3基因缺失后,菌株生长受抑制,几乎无气生菌丝,产孢量显著下降(-98.56%),孢子链变短,无分支,只有1~3个分生孢子串生;Ssn3基因缺失菌株在PDA培养基上菌落比野生型的颜色深,呈黑色,生长变慢,且对过氧化氢、氯化钠及SDS的压力胁迫比较敏感;突变株与野生菌株接种枣和梨果实的结果显示,相比野生型,其对前者的致病力下降了约66%,对后者的致病力下降约94%。但值得注意的是Ssn3基因缺失菌株引起梨果实病斑周围的果肉呈现浅蓝色。2)基因缺失菌株的表型分析显示其产孢量显著下降(-97.62%),孢子链变短,无分支,只有1~3个孢子串生,几乎无气生菌丝;其在PDA培养基上的菌落颜色与Ssn3基因缺失突变体非常相似,比野生型的颜色深,呈黑色,生长变慢,但在5倍的YEG培养基上生长速率却略有增加且菌落呈灰白色;Ssn8基因缺失菌株对压力胁迫测试与Ssn3基因表型类似,也表现出敏感;枣、梨接种结果显示其致病力明显降低,分别下降了约67%和89%。3)Med12基因缺失菌株的表型分析显示其与Ssn3和Ssn8基因缺失表型类似,几乎无气生菌丝,生长速率变慢,产孢量显著下降(-98.08%),分生孢子链变短(1~3个),无分支;其在PDA和5倍YEG培养基上的菌落颜色同Ssn3基因缺失非常相似,呈黑色,生长变慢;对压力胁迫比较敏感;枣、梨接种结果与Ssn8基因缺失菌株类似,致病性明显降低,对枣果实的致病力下降了约71%,对梨果实的致病力下降了约90%。4)Med13基因缺失菌株的表型分析揭示其与另外三个基因明显不同,MedI3基因缺失菌株的产孢量显著下降(-91.24%),分生孢子链变短,无分支,只有1到3个孢子,生长速率变慢;在PCA培养基上与其他三个基因缺失菌株表型类似,几乎无气生菌丝生长减慢,而其在PDA和5倍YEG培养上虽然生长减慢,但气生菌丝比较多、菌落颜色接近野生型;MedI3基因缺失菌株对过氧化氢、氯化钠及SDS压力胁迫的敏感性相对于其他三个突变体的较弱;枣、梨接种结果发现,Med13基因缺失菌株对枣果实的致病力较其他三个突变体略强(-43%),而对梨果实的致病力与野生型无明显变化。通过本研究证明,A.alternata激酶模块CKM中的4个基因都参与调节分生孢子的发育,控制分生孢子链的伸长、分支,从而影响分生孢子的产量。此外,这4个基因对A.alternata菌丝的营养生长很重要,且参与调控A.的致病过程。


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