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白花泡桐丛枝病发生相关ceRNA研究

王哲  
【摘要】:泡桐(Paulownia spp.)是我国重要的速生用材和绿化树种,在防风固沙,改善生态环境,保障我国粮食安全等方面发挥重要作用。由植原体引起的泡桐丛枝病可导致幼树死亡,大树生长量下降,给泡桐产业造成了巨大的经济损失。过去,科技工作者对泡桐丛枝病开展了一系列研究,并取得了一定的进步,但由于植原体难以体外培养,致使泡桐丛枝病的发病机理尚不十分清楚。竞争性内源RNA(ceRNA)在调控基因表达、抵抗环境胁迫、植物生长发育等方面具有重要的生物学意义。本研究以白花泡桐健康苗、丛枝病苗和不同浓度甲基磺酸甲酯(MMS)和利福平(Rif)处理丛枝病苗为材料,开展了ceRNA表达谱,泡桐丛枝病发生特异相关ceRNA调控网络,特异相关miR156f分子功能等研究工作,并取得了一系列成果。现将主要研究结果归纳如下:1.建立了泡桐丛枝病发生模拟系统。本研究利用不同浓度的MMS和Rif处理白花泡桐丛枝病苗,模拟了泡桐丛枝病恢复和发病的过程,60 mg·L~(-1)MMS或100 mg·L~(-1)Rif处理丛枝病苗后,随着处理时间的延长,幼苗逐渐恢复为健康状态,且其体内检测不到植原体。20 mg·L~(-1)MMS或30mg·L~(-1)Rif处理丛枝病苗后,幼苗也可恢复为健康状态,但体内仍含有植原体,将此幼苗继代到不含MMS和Rif的培养基中,幼苗又出现丛枝病症状,并且随着培养时间的延长,体内植原体含量逐渐升高。该结果表明MMS和Rif处理可控制植原体在泡桐体内存在数量,该系统可模拟泡桐丛枝病发生的动态变化过程,克服了植原体不能体外培养的困难,为后续泡桐丛枝病研究奠定基础。2.建立了白花泡桐丛枝病发生的ceRNA表达谱。本研究以模拟系统中两种试剂在不同时间点处理的白花泡桐丛枝病苗和健康苗为材料,通过高通量测序,共鉴定到28,514个转录本,668个miRNA及其4,395个靶基因,5,118个lnc RNA及其7,242个靶基因,9,927个circ RNA及其5,045个hosting基因。GO功能分析显示这些基因主要参与生物过程、转录调控和转录等过程;KEGG分析表明这些基因主要参与植物病原体相互作用、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等代谢通路,意味着这些代谢过程中的基因与泡桐丛枝病发生密切相关,为研究泡桐丛枝病发生提供了数据支撑。3.构建了白花泡桐丛枝病发生特异相关ceRNA调控网络,并进行了转基因验证。本研究以建立的白花泡桐丛枝病发生的ceRNA表达谱为基础,利用趋势分析,共鉴定到与泡桐丛枝病发生相关的17个转录本,4个miRNA,4个lnc RNA和6个circ RNA,通过ceRNA分析,发现了circ RNA7714-miR156f-SPL3是与泡桐丛枝病发生特异相关的ceRNA,并在毛果杨中验证其功能,结果显示miR156f过表达植株分枝增多,Pf SPL3过表达植株未出现分枝现象。该结果为泡桐丛枝病发病机理研究提供了理论依据。4.阐明了白花泡桐丛枝病发生特异相关miR156f及其靶基因Pf SPL3的分子功能。利用降解组测序、RLM-5′-RACE和双荧光素酶报告系统验证了miR156f和Pf SPL3之间的靶向关系。利用酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀和GST-pull down技术发现并证实了SPL3和RPN3之间的互作关系。并发现了Pf SPL3发生了泛素化,且其调控的靶基因主要参与植物激素信号传导、苯丙烷生物合成、碳代谢和油菜素类固醇生物合成等代谢通路。该结果为阐明泡桐丛枝病发病机制奠定基础。


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