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烟草镰刀菌根腐病发生相关根际微生物分析及生防菌筛选

李博  
【摘要】:近年来,烟草镰刀菌根腐病已经成为我国主要产烟区最严重的根茎病害之一,对烟叶生产造成严重的经济损失。对烟草根腐病发生相关的根际土壤微生物群落结构进行系统分析,解析烟草与环境微生物互作对病害发生的影响,并筛选其中具有生防价值的微生物,对实现烟草镰刀菌根腐病的绿色防控具有重要意义。本研究采集河南许昌襄城县烟田病株和健康烟株根际的土壤,在分离鉴定致病镰刀菌的基础上,开展了根际细菌16S r DNA、真菌ITS宏基因组测序分析和拮抗菌筛选,主要研究结果如下:(1)从大田发病烟株根部组织中分离鉴定了两种镰刀菌。分别为茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),这两种镰刀菌在室内盆栽实验均可使烟草发病,接种第8天发病率均达到93.33%,病情指数分别达到36.67、40.00;接种尖孢镰刀菌烟草发病最快,接种第3天可达到86.67%的发病率,接种5天发病率即可达到93.33%,表明这两种镰刀菌均为烟草病原菌,造成根腐症状,其中,尖孢镰刀菌致病性比茄病镰刀菌更强。(2)对镰刀菌根腐病烟株和健康烟株进行根际土壤细菌16S r DNA宏基因组测序,分别检测出分属于22个门、305个属和23个门、280个属的细菌。烟田病株与健康烟株在细菌群落结构的多样性在种类数量上上并不存在显著差异,而在种群结构和丰度上存在明显差异。相对丰度含量前5的优势菌门分别为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria);丰相对度前5的优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)、芽生球菌属(Blastococcus)、Pseudarthrobacter、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、链霉菌属(Streptomyces)。烟田病株与健康烟株在门分类水平上相对丰度存在显著差异的菌门有放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿湾菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)等,在属分类水平上相对丰度存在显著差异的菌属有芽孢杆菌属(Bacillus)、芽生球菌属(Blastococcus)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、链霉菌属(Streptomyces)等。这些菌群丰度差异的存在可能对植物从土壤中获取营养的能力和免疫力产生影响。(3)对镰刀菌根腐病烟株根际和健康烟株根际真菌进行ITS宏基因组测序,分别检测出分属于15个门、66个属和23个门、93个属的真菌。烟田病株与健康烟株在真菌群落结构的多样性在种群数量上存在极显著差异,在种群结构和丰度上也存在明显差异,显示根际真菌种群变化可能与根腐发生更为密切。其中相对丰度含量前5的优势菌门分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、被孢菌门(Mortierellomycota)、油壶菌门(Olpidiomycota);丰度前5的优势菌属分别为镰刀菌属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、产油菌属(Solicoccozyma)、毛霉属(Mucor)、腐质霉属(Humicola)。烟田病株与健康烟株在门分类水平上相对丰度存在显著差异的菌门为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、被孢菌门(Mortierellomycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)等;在属分类水平上相对丰度存在显著差异的菌属为镰刀菌属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、产油菌属(Solicoccozyma)、毛霉属(Mucor)、腐质霉属(Humicola)等。(4)对烟田病株与健康烟株根际土壤真菌采用平板分离法分离,共分离得到788株根际土壤真菌;以茄病镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为靶标菌分别进行拮抗菌初筛,共筛到113株至少对其中一种镰刀菌具有拮抗作用的真菌,以茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、烟草层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、烟草轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)、烟草木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)作为靶标菌,对初筛得到的113株拮抗真菌进一步的拮抗菌筛选,最终筛出5株对5种靶标镰刀菌均具有拮抗作用的菌株;对这5株真菌进行进一步的形态学以及分子鉴定,明确其为两种木霉菌,分别是粗壮木霉(Trichoderma strigosum)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)。本研究针对烟草镰刀菌根腐病发病根际土壤微生物的群落结构进行了系列分析,明确了病株根际微生物菌群与健康植株的差别,为进一步阐明烟草-根际微生物-致病镰刀菌互作机制提供了依据。初步筛选得到两株对5种致病镰刀菌均具有显著拮抗作用的木霉菌,为镰刀菌根腐病的生物防治提供了生防资源,具有明显的应用潜力。


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