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PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析

顾阳  
【摘要】:猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称为奥耶斯基病(Aujeszky’s disease,AD),是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种烈性传染病,育肥期猪呈现体温升高、呼吸道感染症状;哺乳期幼仔感染后通常具有较高致死率;怀孕母猪表现繁殖障碍、流产、死胎、木乃伊胎等。PRV宿主广泛,但猪是已知的唯一自然宿主,也是引起其他动物感染的重要排毒者和疫源,给整个养猪业带来巨大损失。近年来,我国很多地区经过经典疫苗株免疫接种的猪场再次出现猪伪狂犬病疫情,经初步研究发现其为PRV变异毒株感染导致,并且病料样本g E阳性率较高。我国之前大部分猪场使用的是敲除g E基因的Bartha-K61等疫苗,这表明传统的经典疫苗已不能对当前PRV感染提供有效保护,因而找出当前流行毒株的变异程度及野毒的感染情况是当务之急。由于常规的血清学检测方法无法区分疫苗免疫接种动物和野毒感染动物,已知g E基因是野毒感染的标志基因;g H基因是PRV内高度保守和病毒复制所必须的基因,因此根据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)g H、g E基因序列,设计合成2对特异性引物,通过对退火温度等条件进行优化,建立了鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法。特异性分析表明,从强毒株基因组中扩增出2条大小为429bp和355bp的特异性片段,从弱毒株基因组中仅扩增出1条大小为355bp的特异性片段,而扩增猪圆环病毒2型和猪细小病毒基因组结果均为阴性。敏感性分析表明所建立的鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法的最低有效检测量为1×10~2 TCID_(50)/0.1ml。对采自河南省郑州、许昌、濮阳、焦作、洛阳等地市以及山西省文水、河北邯郸的348份PRV疑似病料组织样品进行双重PCR检测,检测病原只需3 h~4 h。该方法具有较高的特异性、敏感性及可重复性,能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染,为PRV野毒的筛查以及PRV的快速检测提供技术支持。从河南、山西和河北收集的5份疑似PRV病料组织匀浆液,经无菌处理后接种于ST细胞,提取每一代收获的细胞病毒液DNA,PCR扩增、电泳,结果均为阳性。将培养至第7代的细胞病毒液接种于6周龄小鼠,攻毒48 h后小鼠开始出现死亡,62 h时全部死亡,而对照组小鼠168 h后仍无发病和死亡现象。表明所获得的5株分离株为PRV强毒株,将其命名为XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2。以XC株为例,进行理化特性试验,结果表明其具有PRV理化特性。XC株在ST细胞上的一步生长曲线结果显示,感染ST细胞后第4-12 h时XC株病毒效价逐渐增长,第36 h达到最高峰(TCID_(50)/m L为10 ~(7.49)),之后病毒效价开始降低。这与PRV在ST细胞上的生长动力规律相吻合。本试验成功分离5株PRV野毒株,为PRV的分离鉴定及控制猪伪狂犬病的流行提供了理论依据。参照Gen Bank中发表的g B和g D基因序列,使用引物设计软件设计2对引物,对实验室分离的5个PRV流行株(XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2)的g B和g D基因进行PCR扩增、克隆、测序及其核苷酸与氨基酸序列分析。结果显示,分离出来的5株流行株虽然来自不同地区,但核苷酸和氨基酸的同源性均较高,对比国内早些年流行株Ea、Fa、SC等,本试验的5个分离毒株g B基因的氨基酸序列,共出现5处共同突变,此5处位点都与国内近年流行毒株的氨基酸保持一致;国内与国外毒株比对发现20多处突变。推导g D基因氨基酸序列发现,相对于国内早年流行株,在278位处国外毒株(除Becker和NIA3外)和国内近些年流行变异株出现了氨基酸位点缺失;相对于国外毒株(除Becker和NIA3外),包括5个分离毒株在内的国内毒株共发生了8处位点共同突变。研究结果表明5个分离毒株与国外流行毒株由于地理隔离的存在差异较大,不同地区PRV毒株的感染和流行情况并不相同;5个分离毒株与2011年之前国内流行毒株亲缘关系较远,表明2011年以来我国PRV流行毒株发生了变异,可以推断出我国在2011年之后可能是由于出现了PRV变异毒株而导致不同地区PR疫情的发生;遗传进化树结果表明,这些分离的毒株与之前的经典毒株如Bartha-K61等亲缘关系较远,这也解释了为何我国近年各地已经免疫的猪场还是有PRV感染发生。


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