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小麦转录因子TaMADS2参与磷胁迫响应的机制及其功能研究

韩迎春  
【摘要】:小麦是世界上最主要的粮食作物之一,为人类饮食提供淀粉和能量。小麦的稳产和高产对保障我国粮食安全具有重要意义,然而土壤矿质营养缺乏和各种病害的发生都严重影响小麦生长及产量。土壤中有效磷缺乏是限制小麦生长的关键因子之一,深入探究小麦磷胁迫响应基因的分子调控机制,将有助于小麦磷营养高效基因资源的发现和利用;对目标养分胁迫基因在免疫体系中的交叉作用的探索也有助于小麦抗病机制研究和新种质的创制。本研究对小麦磷胁迫响应转录因子TaMADS2进行了克隆和生物信息学分析,在拟南芥中异源表达TaMADS2分析其在低磷胁迫中的功能和调控途径,通过创制过表达和RNAi小麦材料解析其生物学功能,同时还对TaMADS2在小麦响应叶锈菌侵染中的作用进行了研究。本研究主要结果如下:1、采用水培方式对小麦品种郑麦9023、西农979、济麦17、百农207、Fielder进行长期低磷处理(7天),通过RT-q PCR检测根系中TaMADS2的表达,结果显示在低磷处理7天时TaMADS2在不同小麦品种中均显著下调表达。然后,对郑麦9023进行短期低磷处理(0-24 h),RT-q PCR检测结果显示在低磷处理3 h时TaMADS2表达显著上调,而随着胁迫时间的延长表达逐渐下降。这表明TaMADS2在小麦磷缺乏早期受到显著诱导,可能在磷胁迫响应上游发挥重要调控作用。2、研究克隆了TaMADS2全长编码序列,通过蛋白结构域预测和进化树分析显示TaMADS2基因属于MADS-box转录因子家族中I类亚家族的Mα亚类,是禾本科作物中比较保守的一类基因,而且TaMADS2的基因结构比较特殊,包括5个外显子和4个内含子,其中第一内含子特别大。亚细胞定位实验表明TaMADS2蛋白定位于细胞核内,但是酵母实验发现该基因不具有转录激活活性,说明该基因可能通过蛋白复合体形式发挥活性。对小麦苗期全苗c DNA文库进行酵母双杂交筛选,获得了候选的互作蛋白基因,如IAA-like、TRX-like等,其互作机制尚待进一步证实和研究。3、在拟南芥中异源表达TaMADS2,对鉴定后的T3过表达株系SM和野生型(WT)植株进行低磷处理,结果显示:相比正常磷营养条件,低磷处理后SM和WT植株的变化趋势一致,即主根长显著降低,侧根密度明显增加,生物量降低,花青素积累增加等,但是SM的变化幅度相比WT降低。在正常磷营养条件下,SM植株表现出主根长显著降低,地上部和根鲜重降低,根尖、侧根密度显著增加,花青素积累增加,总磷含量根冠比增加,这些变化趋势与WT低磷诱导变化趋势一致,表明TaMADS2可以通过调控磷胁迫响应(PSR)途径基因,进而影响植株生长尤其根形态变化。4、通过RNA-seq技术对SM和WT植株根系在不同磷营养条件下的差异表达基因进行分析,结果显示:在正常磷营养条件下,与WT相比,TaMADS2过量表达引起SM根系中部分磷胁迫响应基因的显著差异表达,其变化趋势与WT在低磷处理后的表达变化趋势一致,如AtZAT6、At SPX1、At PHT1;8等。此外,SM_+P VS WT_+P差异表达基因中还包括其他转运蛋白基因、氧化还原相关基因、参与植物防御过程的转录因子等。对SM_+P VS WT_+P的显著差异表达基因进行GO注释富集分析,发现有5个生物学过程显著富集,分别为次级代谢、氧化胁迫响应、karrikin响应、无机磷转运、无机阴离子转运。通过对转录组差异表达基因的进一步验证分析确认SM_+P诱导了部分PSR功能基因的表达,表明TaMADS2可能通过调控AtZAT6等的表达,来介导活性氧的平衡进而调节根系发育,影响根系对磷胁迫的响应。5、通过农杆菌介导的小麦遗传转化获得TaMADS2过表达和沉默表达(RNAi)的小麦植株,对不同磷浓度水培条件下的CM和WT植株进行表型统计,结果显示:低磷处理后,CM和WT植株表型变化趋势一致,但是在正常磷营养条件下,TaMADS2高表达的CM5株系生长减弱,株高、根长、鲜重等显著降低,与TaMADS2过表达拟南芥植株表型一致,而非过表达TaMADS2的CM10株系(CK)则与WT无显著差异,表明TaMADS2在小麦中的表达量变化能够影响植株的生长发育。6、对不同小麦品种叶片进行叶锈菌侵染,在侵染不同时间点检测TaMADS2表达变化,结果显示TaMADS2表达在侵染后48 h被显著抑制。对CM5叶片侵染叶锈菌后的观察发现TaMADS2过量表达增加小麦对叶锈的感病性,而通过BSMV-VIGS技术沉默TaMADS2表达则降低小麦对叶锈的感病性,表明TaMADS2负调控小麦对叶锈菌的抗性。本研究主要阐述了小麦MADS-box转录因子基因TaMADS2在磷胁迫响应调控中的作用和转录调控途径,同时证明该基因在小麦响应叶锈菌侵染中的作用,本研究结果将为小麦磷有效利用和抗病性改良方面提供新的基因资源和理论依据。


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