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利用转录组测序技术寻找绵羊妊娠毒血症抗病育种靶基因

康绍华  
【摘要】:随着大规模舍饲绵羊产业的发展,妊娠毒血症(OPT)对绵羊生产造成的危害日益增大,研究绵羊妊娠毒血症分子机制,培育抗OPT绵羊变得越来越迫切。目前,对绵羊OPT的研究多是关于发病机理、诊断治疗等方面,有关绵羊OPT转录表达调控的很少。本课题组前期对脂代谢相关候选基因DAGLA、HMGCS2、DLD、DLAT的遗传变异以及FecB与绵羊OPT相关性进行了分析,并对OPT绵羊血液生理生化指标的变化进行了分析。在此基础上,本试验以河南中鹤牧业有限公司相同饲养条件下的300只杜湖杂交母羊为研究群体,同期发情处理并同期进行腹腔镜子宫角输精,在同样的饲养环境下自然生长至妊娠130d~145d时采集血样检测生理生化指标。从试验羊群中选3只患OPT的母羊与3只健康妊娠母羊采集肝脏组织,使用Illumina Hiseq 4000高通量转录组测序技术进行lncRNA、miRNA测序,进行生物信息学分析,寻找差异表达基因,用RT-PCR方法对7个差异基因进行验证。本研究旨在揭示绵羊OPT发生的分子机制,为肉羊抗病育种和防治提供理论依据。主要结果如下:(1)OPT羊生理病理状态确定:在观察临床症状的基础上,在孕龄130d~145d时测定研究群体生理生化指标。3只OPT羊的血清葡萄糖含量分别为0.87mol/L、0.72mol/L、0.412mol/L;血清钙含量分别为1.93mol/L、1.71mol/L、1.65mol/L;血清天门冬氨酸氨基转移酶含量分别为115.36 U/L、109.76 U/L、98.65 U/L;D-3-羟丁酸含量分别为 4.63 mmol/L、4.26mmol/L、3.43mmol/L 均符合 OPT羊的诊断特征。选择与OPT羊只同一圈舍内且B超显示的胎儿数与实验组羊只胎儿数相等的健康妊娠羊做为对照组,对照组3只羊血清葡萄糖含量分别为2.27mol/L、2.39mol/L、1.99mol/L;血清钙含量分别为2.31mol/L、2.45mol/L、2.19mol/L;血清天门冬氨酸氨基转移酶含量分别为73.84U/L、70.47U/L、62.33U/L;血液 D-3-羟丁酸含量分别为 0 mmol/L、0.21mmol/L、0.16mmol/L 均符合健康妊娠羊的特征。(2)mRNA差异表达分析:OPT母羊肝脏显著上调的mRNA共632个(log2FoldChange1,FDR0.05),显著下调的 mRNA 共 1131 个(log2FoldChange-1,FDR0.05),对差异表达基因进行GO功能富集分析发现显示富集的功能有脂质代谢过程、免疫反应、有机羟基化合物代谢过程、有机酸代谢过程、氧化还原酶活性、单氧酶活性等。KEGG通路富集分析显示富集的通路有金黄色葡萄球菌感染、造血细胞谱系、视黄醇的新陈代谢、类固醇生物合成、甾类激素生物合成等。lncRNA差异表达分析:对3只OPT母羊和3只正常妊娠母羊肝脏组织进行lncRNA测序,OPT母羊肝脏显著上调的lncRNA共17个(log2FoldChange1,FDR0.05),显著下调的lncRNA共1 1个(log2FoldChange-1,FDR0.05)。对差异表达基因进行GO功能富集分析显示富集的功能有血液凝固、凝固、止血、巨噬细胞融合、线粒体丙酮酸脱氢酶复合物、丙酮酸脱氢酶复合体、丙酮酸脱氢酶激酶活性等;KEGG通路富集分析显示富集的通路有B细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路等。(3)miRNA差异表达分析:对3只OPT母羊和3只正常妊娠母羊肝脏组织进行miRNA测序,OPT母羊肝脏上调的miRNA共5个(log2FoldChange1,FDR0.05),显著下调的miRNA共8个(log2FoldChange-1,FDR0.05)。对差异miRNA靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析发现差异表达基因在组蛋白甲基转移酶活性、GTPase催化剂活性成肌细胞分化等方面富集;KEGG代谢通路中显著富集的通路有乳糖生物合成、嘧啶代谢等。(4)差异表达基因的荧光定量PCR验证:采集3只OPT羊与3只正常妊娠母羊的肝脏组织样本,利用荧光定量 PCR 技术检测 PDK1、CD81、SETD5、SUV39H2、ARHGAP19、ARMC12、ASHIL等7个基因的表达量,结果显示,荧光定量PCR结果与测序分析结果一直,说明测序分析结果可靠,这7个差异表达基因可作为绵羊妊娠毒血症靶基因进行抗病育种研究。综上所述,本试验采用转录组测序方法,对试验组3只OPT羊与对照组3只正常妊娠母羊肝脏进行差异分析。试验组显著上调的mRNA共632个(log2FoldChange1,FDR0.05),显著下调的mRNA共1131个(log2FoldChange-1,FDR0.05),对差异表达基因进行GO、KEGG富集分析发现显著富集的功能有脂质代谢过程、免疫反应等,富集的通路有视黄醇的新陈代谢、类固醇生物合成等。试验组显著上调的lncRNA共17个(log2FoldChange1,FDR0.05),显著下调的lncRNA共11个(log2FoldChange-1,FDR0.05),差异表达基因显示富集的功能有线粒体丙酮酸脱氢酶复合物、丙酮酸脱氢酶复合体、丙酮酸脱氢酶激酶活性等;KEGG通路富集分析显示富集的通路有B细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路等;患OPT绵羊肝脏显著上调的miRNA共5个,显著下调的miRNA共8个,差异基因多在组蛋白甲基转移酶活性、GTPase催化剂活性等方面富集,在乳糖生物合成、嘧啶代谢等通路富集。荧光定量PCR验证了 7个差异表达基因,可作为绵羊妊娠毒血症抗病育种靶基因进行大群验证。本研究可能是对OPT在转录组水平上进行的首次研究,为揭示OPT分子病理机制以及进行抗病育种提供了有价值的资料。差异基因的功能尚需进一步的研究。


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