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软枣猕猴桃原生质体培养及基因转化研究

秦永华  
【摘要】: 软枣猕猴桃(A. arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的种之一其果实表面光滑无毛,果汁多,风味好,Vc含量高,抗虫、抗病性强,极耐寒,在-38℃下可安全越冬,是品种改良的重要种质资源。 软枣猕猴桃生物技术方面的研究不多,有关悬浮培养、原生质体培养及遗传转化的研究更少。针对这种情况,本试验对软枣猕猴桃的组织培养、悬浮培养、原生质体培养及其遗传转化进行了研究,建立了比较理想的组织培养和悬浮培养体系,在此基础上,对叶肉、叶愈伤组织和悬浮培养来源的原生质体进行了培养,均获得了细胞团,并且叶愈伤组织来源的原生质体获得了肉眼可见的小愈伤组织。通过PEG介导法将GUS基因导入软枣猕猴桃原生质体,获得了瞬间表达。主要试验结果如下: 以软枣猕猴桃试管苗茎段和叶片为外植体,接种在20个附加不同激素配比的MS培养基上诱导愈伤组织和芽分化。结果表明,在1/2MS、MS和MS+IAA0.8mg/L+ZT1.0mg/L的培养基对芽分化和植株的生长有良好的效果。附加2,4-D0.5mg/L+ZT2.0mg/L+NAA0.3mg/L和ZT2.0mg/L+NAA0.3mg/L的MS培养基对叶片的愈伤组织诱导效果比较理想。 将附加ZT2.0mg/L和NAA0.3mg/L的MS培养基上诱导的白色或浅绿色叶片愈伤组织接种到10个附加不同激素配比的MS液体培养基上进行悬浮培养,结果表明,最适宜软枣猕猴桃悬浮培养的培养基是MS+2,4-D1.0mg/L+NAA0.3mg/L。 以软枣猕猴桃试管苗的叶肉、叶愈伤组织和悬浮细胞为游离原生质体的材料。起始材料的生理状态对原生质体分离效果及培养有显著影响。材料经低温处理(4℃)暗培养2-7天后有利于原生质体的分离和培养。不同材料来源的原生质体培养在附加不同激素配比和不同浓 度MP的峭(去NH。”)、BS、KMSP、NT和 CPW五种培养基上,适宜软 枣猕猴桃原生质体的培养基为MS(去NH。‘)。MS(去NH。‘)培养基附 力 ZT 配合2,4-D 或KT 对启动分裂是必须的。MS+2,4- D0.50mg/L+ZTO.5。g/L和 MS+2,4-DI.omg/L+ZTO.5。g/L培养基分别对 叶肉、愈伤组织来源的原生质体培养效果较好。叶片愈伤组织来源的原生 质体在改良MS液体培养基上培养5{天出现第一次细胞分裂,14天出现 第h次细胞分裂,30大形成多细胞团,55天形成肉眼可见的小愈伤组 织。用琼脂糖包埋法培养叶肉原生质体,培养三周的分裂频率为19.S%, 植板率为10.9抚 对游离出来的软枣猕猴桃原生质体用PEG介导法进行遗传转化, 成功地将GUS基因导入原生质体,并获得了瞬间表达。影响PEG转化 的因素主要有:材料的生理状态,PEG的种类和浓度。适宜的转化条件 为:40%PEG溶液(W6000)(终浓度为 8.2们,用等体积的 CPW洗 液和 0.ZM CaClz的混合溶液稀释。 以上这些研究结果为软枣猕猴桃体细胞杂交、转基因体系的建立 以及资源的开发和利用创造了条件。特别是继中华猕猴桃、美味猕猴 桃以及毛花猕猴桃等3个种原生质体培养获得再生植株之后,关于软 枣猕猴桃原生质体再生植株迄今还未见报道,我们的工作为软枣猕猴 桃原生质体再生植株打下了坚实的基础。


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