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烟草花叶病毒地黄分离物移动蛋白基因的克隆、序列分析及对番茄的遗传转化

杨学习  
【摘要】: 根据已发表的TMV MP基因的核苷酸序列设计引物,以感染TMV的地黄(Rehmannia glutinosa libosch)叶片总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得TMV地黄分离物MP基因的目的片段。将其克隆到pMD-18-T vector上,得到含有完整MP基因的重组质粒pTMP-D。序列分析表明:移动蛋白基因全长804bp,编码268个氨基酸。与TMV-U1株系的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为78%和80%。因二者核苷酸序列同源性较低,推测该分离物可能为烟草花叶病毒的一个新株系,有关该分离物的生物学特性和全基因组序列正在进一步研究。 利用PCR方法对获得的TMV地黄分离物MP基因进行缺失改造,在MP基因5′端缺失掉21bp的核苷酸。分别将全长的和5′端缺失的MP基因克隆到原核表达载体pET-30a上,构建了全长和缺失型MP基因的原核表达载体pEMP-F和pEMP-D。 以番茄常规品种中蔬6号为试材,对番茄的再生转化系统进行了研究。以番茄子叶为外植体,适宜的分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.2mg/L。在番茄的遗传转化中,卡那霉素(kanamycin)的筛选压和头孢菌素(cephalosporin)的抑菌浓度分别以10mg/L和400mg/L为宜。 将全长和5′端缺失的MP基因通过中间载体pROK219克隆到双元植物表达载体pBIN19上,构建了全长及缺失型MP基因的植物表达载体pBMP-F和pBMP-D。上述植物表达载体在土壤农杆菌LBA4404介导下,转化番茄生产品种“中蔬6号”,目前已获得愈伤组织,进一步的工作正在进行之中。


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