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软枣猕猴桃原生质体培养及GFP基因转化研究

米银法  
【摘要】: 软枣猕猴桃(A. arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的种之一,是猕猴桃品种改良的重要种质资源。由于软枣猕猴桃具有质细多汁,可溶性固形物和维生素C含量均高,而且不用剥皮即可鲜食的特点,因此对软枣猕猴桃的研究越来越受到重视。 该论文以“魁绿”品种软枣猕猴桃种子实生苗为试材进行原生质体培养及GFP基因遗传转化的研究,取得以下主要试验结果。 1.以软枣猕猴桃种子为材料建立无菌苗体系时,种子处理应用13%的NaClO消毒20min。消毒后若仍有部分污染,待长成小苗后用0.1%升汞二次消毒,时间3 min为好。 2.比较了1/2MSo+蔗糖30g/L、1/2MSo+蔗糖10g/L、MSo+蔗糖30g/L、MSo+蔗糖10g/L四种不同培养基对猕猴桃组培幼苗生长状况的影响,结果发现MSo培养基明显优于1/2MSo培养基。就蔗糖在组培中的作用来讲,含30g/L蔗糖的培养基要优于含10g/L蔗糖的培养基。 3.比较了液体浅层、固液双层和低熔点琼脂糖包埋3种培养方法对愈伤原生质体培养的影响,培养基均采用MS+2,4-D1.0mg/L+ZT0.025 mg/L+1.0%PVP。结果发现,对愈伤原生质体而言,低熔点琼脂糖包埋培养,原生质体5~6 d开始分裂,比液体浅层早1~2d;20d后的植板率为7.29%。包埋培养25~30d后即可出现小的细胞团。叶片来源的原生质体,同样以琼脂糖包埋培养法效果最好。 4.试验还比较了MS、KM8p、NT和CPW 4种培养基在附加2,4-D1.0 mg/L+ZT0.025 mg/L+1.0%PVP时的原生质体的浅层培养效果,通过比较看出,改良MS液体培养基原生质体出现第一次分裂的时间早,分裂率可高达11%,二次分裂率可达2.3%,褐化程度低,褐化率为12.5%,而且细胞团的出现时间早。KM8p培养基培养,第一次分裂率为1.5%,不到15天原生质体已开始褐化,而且褐化严重。用Ms和CPW培养基培养的原生质体褐化率较轻,分别为12.5%和10.8%, 但Ww培养基培养的原生质体很难出现二次分裂细胞。 5.在WP基因转化方面,试验采用 10%PEG、20qPEG禾 28*PEG三种不 8司 的浓度进行比较。发现 10赃EG介导下叶片和愈伤原生质体上的基因转化率基本 上都在1%左右;20账EG介导下叶片原生质体的导入率在10%左右,愈伤原生质 体的导入率在5%左右;PEG浓度为28%时虽然GFP的导入率稍有增加,但同时原 生质体破碎的比率也有所增加,同时细胞粘连严重。为了既能保持较高的基因 i 转化率,又能保持原生质体较好的状态,我们在试验的过程中,采用了20仆6G 加热激处理的方法,使得 GFP基因在叶片原生质体上的转化率达到了 11.7“在 愈伤组织原生质体上的转化率达到了6.09儿 以上这些研究结果为软枣猕猴桃体细胞杂交、转基因体系建立以及资源开 发和利用创造了条件。


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