软枣猕猴桃原生质体培养及GFP基因转化研究

【摘要】： 软枣猕猴桃(A. arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的种之一，是猕猴桃品种改良的重要种质资源。由于软枣猕猴桃具有质细多汁，可溶性固形物和维生素C含量均高，而且不用剥皮即可鲜食的特点，因此对软枣猕猴桃的研究越来越受到重视。 该论文以“魁绿”品种软枣猕猴桃种子实生苗为试材进行原生质体培养及GFP基因遗传转化的研究，取得以下主要试验结果。 1．以软枣猕猴桃种子为材料建立无菌苗体系时，种子处理应用13％的NaClO消毒20min。消毒后若仍有部分污染，待长成小苗后用0.1％升汞二次消毒，时间3 min为好。 2．比较了1／2MSo+蔗糖30g／L、1／2MSo+蔗糖10g／L、MSo+蔗糖30g／L、MSo+蔗糖10g／L四种不同培养基对猕猴桃组培幼苗生长状况的影响，结果发现MSo培养基明显优于1／2MSo培养基。就蔗糖在组培中的作用来讲，含30g／L蔗糖的培养基要优于含10g／L蔗糖的培养基。 3．比较了液体浅层、固液双层和低熔点琼脂糖包埋3种培养方法对愈伤原生质体培养的影响，培养基均采用MS+2，4-D1.0mg／L+ZT0.025 mg／L+1.0％PVP。结果发现，对愈伤原生质体而言，低熔点琼脂糖包埋培养，原生质体5～6 d开始分裂，比液体浅层早1～2d；20d后的植板率为7.29％。包埋培养25～30d后即可出现小的细胞团。叶片来源的原生质体，同样以琼脂糖包埋培养法效果最好。 4．试验还比较了MS、KM8p、NT和CPW 4种培养基在附加2，4-D1.0 mg／L+ZT0.025 mg／L+1.0％PVP时的原生质体的浅层培养效果，通过比较看出，改良MS液体培养基原生质体出现第一次分裂的时间早，分裂率可高达11％，二次分裂率可达2.3％，褐化程度低，褐化率为12.5％，而且细胞团的出现时间早。KM8p培养基培养，第一次分裂率为1.5％，不到15天原生质体已开始褐化，而且褐化严重。用Ms和CPW培养基培养的原生质体褐化率较轻，分别为12.5％和10.8％， 但Ww培养基培养的原生质体很难出现二次分裂细胞。 5．在WP基因转化方面，试验采用 10％PEG、20qPEG禾 28＊PEG三种不 8司 的浓度进行比较。发现 10赃EG介导下叶片和愈伤原生质体上的基因转化率基本 上都在1％左右；20账EG介导下叶片原生质体的导入率在10％左右，愈伤原生质 体的导入率在5％左右；PEG浓度为28％时虽然GFP的导入率稍有增加，但同时原 生质体破碎的比率也有所增加，同时细胞粘连严重。为了既能保持较高的基因 i 转化率，又能保持原生质体较好的状态，我们在试验的过程中，采用了20仆6G 加热激处理的方法，使得 GFP基因在叶片原生质体上的转化率达到了 11．7“在 愈伤组织原生质体上的转化率达到了6．09儿 以上这些研究结果为软枣猕猴桃体细胞杂交、转基因体系建立以及资源开 发和利用创造了条件。