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单抗介导的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)快速检测禽流感病毒

黄娟  
【摘要】: 将禽流感病毒(AIV H_5N_1、H_9N_2)纯化制成抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA筛选,建立了1株抗禽流感病毒的杂交瘤细胞株:2C_8,其分泌抗体能力稳定,经Western-blotting鉴定为针对NP蛋白的单抗,免疫球蛋白亚类属于IgG_1。分泌的单克隆抗体与AIV H_5N_1、H_9N_2各毒株和A型SIV H_1N_1、H_3N_2均发生反应,但对鸡NDV、IBDV、EDSV及IBV均无交叉反应,表明该单抗具A型流感群特异性。此杂交瘤细胞上清、腹水ELISA效价分别为2~7、2~(11),但无血凝抑制性和中和活性,对热稳定性良好。腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,蛋白含量为2.113mg/ml。此单克隆抗体的获得为A型流感病毒病原的研究、流感快速诊断方法的建立奠定了基础。 利用获得的单克隆抗体和胶体金标记技术,在国内首先建立了快速检测AIV的DIGFA(夹心法)。检测时先将单抗点样于NCM中央,封闭后与待检抗原作用10min,洗涤后再与胶体金标记纯化的兔抗AIVIgG作用5min,洗涤后观察。在膜上出现红色斑点的为阳性,不出现斑点为阴性。用此法检测AIV H_5N_1、H_9N_2、SIV毒株均为阳性,而NDV、IBDV、EDSV及IBV等均为阴性;对AIV H_9N_2纯化抗原及含毒尿囊液最低检出量分别为1.799ng/点(2μl)、10~3EID_(50);检测AIV H_9N_2在鸡胚中繁殖时以66-92h含毒量最高;检测H_9N_2 SPF攻毒鸡泄殖腔棉拭子,至少感染后2-8天内可检出病毒,与病毒分离结果一致;对H_5N_1攻毒死亡鸡气管的病毒检出率80%;自然感染鸡气管10份能检出9份,与病毒分离的阳性符合率在90%以上。实践证明该法具有A型流感群特异性,可用于AIV早期诊断,其快速、敏感、简便,不需特殊设备、30分钟就能判定结果的特点,更适于基层实验室或现场应用。


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