小麦淀粉合成关键酶基因启动子的克隆与特征

【摘要】：淀粉是高等植物碳水化合物的主要储存形式。利用基因工程技术 对小麦淀粉品质改良是可行且有效的一种方法，而选择适宜的胚乳特 异启动子对于特定基因表达调控并实现农作物新品种培育尤为重要。 能够在小麦胚乳中表达且表达时间及强度与淀粉合成具有相关性的 启动子仍有待克隆和功能分析研究，具有高表达活性的胚乳特异启动 子也尚待发现或构建。 淀粉合成是一个复杂生化的过程。在此过程中存在四种关键酶： ADP 焦磷酸化酶（AGP）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（BE）和 去分支酶（DBE）。在小麦籽粒成熟过程中，此四种酶对淀粉包括直 链淀粉和支链淀粉的生物合成数量及比例起重要作用，从而影响淀粉 的品质和用途。 为了解以上 AGP、GBSS 和 SBE 三个关键酶基因的调控机理及 胚乳特异表达特性，本文依据以往小麦淀粉生物合成有关研究结果， 进行了以下研究工作： 1. gbss、sbeIIa 及 agp 启动子的克隆 利用 APCR 和 IPCR 方法对小麦（豫麦 18）gbss、sbeIIa 及 agp 基因启动子进行克隆，并对 gbss(GenBankAY278458)4.1Kb 和 sbeIIa (Gen -Bank AY357072)启动子片段 3.09Kb 进行测序和序列分析。在 对上述启动子未知片段进行克隆的过程中，也使用了 IPCR 方法，并 进行了 Nested PCR 等优化策略。研究利用 APCR 成功地克隆出小麦 i WP=13 河南农业大学博士学位论文 gbssI 和 sbeIIa 启动子序列。 2. 小麦胚乳瞬间表达体系的确立 本文利用 CaMV 35S-UidA 载体对小麦胚乳瞬间表达体系进行了 研究。研究发现，影响小麦胚乳 GUS 活性的因素有多种，包括小麦 胚乳年龄、胚乳预培养与否以及轰击压力等。剥离当天的小麦胚乳 6-16DPA(day post anthesis)可以用于基因表达活性检测，但以 8-10 DPA 为最好，过嫩或过老的胚乳细胞活性明显降低，影响 GUS 表达； 剥离后的预培养处理使三倍体的胚乳组织活性降低，不利于 GUS 活 性的表达和检测，应以剥离当天进行基因枪轰击为好；可以选择 650-1100psi 压力进行基因枪轰击，轰击压力降低到 900psi 时，部分 胚乳中 GUS 表达的蓝点数增加，相对降低轰击压力，有利于 GUS 基 因的表达和检测。本次研究还对小麦不同品种进行了轰击和 GUS 活 性检测，没有发现品种与 GUS 活性之间存在必然的联系。 3. sbeIIa 和 pbf 启动子各缺失体的功能缺失研究 为对所克隆的 sbeIIa 启动子和与三基因有一定密切关系的调控 因子 pbf 启动子功能及活性有所了解，首先利用小麦胚乳瞬间表达系 统进行了 sbe.a-g 和 pbf.a-d 启动子缺失体的功能检测。研究结果表明 1- 3094 bp 序列(存在于 sbe.g 融合体中)具有稳定的启动子活性， 5' 缺失体(sbe.b)的启动子活性明显降低，在缺失-1210- -1bp(sbe.a)情况 下，启动子活性仍较高；3' 缺失体(sbe.c)在缺失-1641--1bp 的情况下， 蓝点数目少，GUS 活性极低；在 sbeIIa 启动子中间缺失体中，一些 缺失体仅有微弱活性(sbe.f)或没有活性(sbe.d)，当启动子缺失-1579- ii WP=14 河南农业大学博士学位论文 1210 bp 片段(sbe.e)时，仍具有与启动子全长序列(sbe.g)相当的启动子 活性。 在 pbf 启动子缺失体中，5'和 3'缺失使启动子的活性丧失，中间 缺失体(pbf.c)有弱启动子活性，全长启动子序列(含 pbf.d)在 10DPA 胚 乳中的最高 GUS 活性为 9.45 蓝点/胚乳，略高于 sbeIIa 启动子。 启动子功能缺失研究初步证明一些基序（motifs），如 -300bp element、G-box 以及 Prolamin-box 等调控因子在决定启动子胚乳特异 表达模式中是必需的。研究也发现，改变瞬间表达体系的某一因素（如 轰击压力、胚乳年龄等），各缺失体的活性变化规律也有所不同，为 进一步验证瞬间表达体系下各缺失体的启动子活性，本文同时进行了 sbe.a-g 启动子缺失体在小麦盾片转化试验，并获得部分缺失体的阳性 转基因植株，用以 sbe.a~g 的长久表达检测。 4. pRgbss 反义表达载体的构建及转化 运用反义技术并利用 gbss 基因和自身启动子构建了 gbss 反义基 因表达载体 pRgbss，同时将此表达载体转入小麦盾片中并获得转基 因植株，为利用基因工程方法改良小麦淀粉品质提供理论基础和有效 途径。 综上所述，本文对小麦淀粉合成关键酶基因 gbssI、sbeIIa、agp -s 以及相关基因 pbf 启动子进行了探索和研究，利用 APCR 技术克隆了 gbssI 基因的 1-4010bp 启动子序列和 sbeIIa 基因的 1-3094bp 启动子序 列，同时根据 sbeIIa 和 pbf 启动子各缺失体调控下的 GUS 基因表达 活性情况，初步确定 sbeIIa 启动子在小麦胚乳中的最短有效片段为 iii WP=15 河南农业大学博士学位论文 -513- -1bp， pbf 启动子有效表达片段为已知 1-2461bp 全长序列并获 得 sbeIIa 启动子各缺失体的小麦转化植株；已克隆的 gbssI、sbeIIa 和 pbf 启动子序列具有启动子活性，可以用于基因表达构建；在对启 动子序列有关基序进行胚乳特异表达的功能分析中，确定-300bp elemen -t、G-bo