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基因枪法将HMW-GS(5+10)基因转入小麦的研究

孙红正  
【摘要】: 本试验采用基因枪方法,以带有小麦高分子量麦谷蛋白5亚基和10亚基基因的高效表达载体转化小麦受体品种豫麦18号、豫麦21号、豫麦49号和豫农9901,以期得到高效表达高分子量麦谷蛋白5亚基和10亚基的小麦新种质。为了减少转基因沉默、提高外源基因表达量,在目的基因的两侧构建了核基质结合序列MAR,并在基因末端加上了内质网滞留信号(KDEL)编码序列以期提高目的基因表达水平。 对基因枪轰击小麦幼胚愈伤组织过程中几个重要参数的研究结果表明,在同等条件下250 μg 枪-1的金粉用量优于500 μg 枪-1,颗粒直径1.0 μm的金粉转化效果好于直径1.6 μm金粉,单枪与双枪差别不大,可裂膜片压力为1300 psi时,轰击后愈伤组织的再生绿点率明显高于可裂膜片为1100 psi时的绿点率,9 cm靶距的处理效果较好。 试验中4个基因型共得到146株再生植株,对5亚基基因进行的PCR鉴定表明在所有146株植株中,出现预期大小DNA片段的植株有141株,有5株未扩增出预期片段,平均PCR阳性率达到96.57%。其中豫麦18号117株中有114株PCR检测为阳性,阳性率达到97.44%,豫麦21号3株为阳性,豫麦49号24株中22株检测结果为阳性,阳性率为91.67%,豫农9901仅有1株,PCR检测结果为阳性。对10亚基基因进行的PCR鉴定表明出现预期大小DNA片段的植株有138株,有8株未扩增出预期片段,平均PCR阳性率达到94.52%。其中豫麦18号117株中有112株PCR检测为阳性,阳性率达到95.72%,豫麦21号4株均为阳性,豫麦49号24株中21株检测结果为阳性,阳性率为87.5%,豫农9901 1株,PCR检测结果为阳性。 对转基因植株T0代的种籽所做SDS-PAGE的电泳结果表明,豫麦21号、豫麦49号、豫农9901的种籽高分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE带型均未发生变化,豫麦18号117株中,有7株的种籽蛋白带型发生了变化,与未转基因的对照相比,这7株的高分子量麦谷蛋白带型均出现比对照的带型多出2条比较明显的带。但是,这2条带的位置与预期的5亚基与10亚基在SDS-PAGE上的位置并不一致。7株带型有变化的再生植株全部为不带KDEL编码序列质粒的转化植株,这一现象有待进一步研究。


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