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赤拟谷盗热激蛋白70基因的竞争定量PCR系统的构建

董晓慧  
【摘要】:利用RT-PCR技术构建了赤拟谷盗(Tribolium castaneum)热激蛋白 70基因的竞争定量PCR系统.竞争性对照模板的构建方法是:利用计算机 辅助优选设计引物,在合适的退火温度下,得到单一的特异性强的赤拟 谷盗的热激蛋白70靶标基因的条带,而后降低退火温度,从几条非靶标 的条带中选择一条,后经胶回收纯化、连接、转化,最后得到纯的质粒。 此质粒就是在赤拟谷盗的竞争定量PCR系统中的竞争性对照模板,它与 赤拟谷盗的热激蛋白70靶标基因的两端都含有PCR引物DNA序列,但是 它们的PCR产物的分子量不同,并且能通过琼脂糖凝胶电泳区分开来。 在竞争PCR中,利用系列浓度稀释后的竞争性对照模板与靶标DNA在同 一试管中反应,由于它们互相竞争PCR引物的结果,靶标PCR产物和竞争 性对照模板PCR产物的量呈线性相关。利用光密度分析仪得到竞争性对 照模板PCR产物和靶标PCR产物的相对量,并可以得到它们之间的比值。 由它们之间的比值,我们绘制了竞争性对照模板的初始浓度与竞争性对 照模板PCR产物和靶标PCR产物比值之间的标准曲线,并得到它们之间的 线性方程为Y=1.032X-1.618,其中相关系数r2=0.975。 本研究利用降低退火温度的方法得到了对赤拟谷盗热激蛋白70基因 进行竞争PCR定量的内部竞争物,通过内部竞争物和目的基因共同竞争底 物和引物,得到它们的PCR产物的比值,绘制它的标准曲线,建立了它的 竞争定量PCR系统,为它的热激蛋白70基因定量提供了方便,并为研究 热激蛋白在转录水平上的表达规律奠定了基础。同时,为在昆虫中构建 竞争定量PCR系统的理论提供了依据。


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