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TMV-RH基因组近全长序列测定及CP基因和MP基因对烟草的遗传转化

张丽芳  
【摘要】:根据已发表的TMV基因组的核苷酸序列设计5对简并引物,以感染TMV的地黄(Rehmannia glutinosa)叶片总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得TMV-RH的5个核苷酸片段的cDNA。分别将其克隆到pMD-18-T vector上,得到5个含有目的cDNA片断的重组质粒。对重组质粒的测序结果表明,这5个片段相互重叠并覆盖TMV全基因组,经拼接后获得了TMV-RH的近全长基因组序列。根据已测得的6000bp核苷酸序列与TMV-U1株系的比较结果可知,TMV-RH基因组含有4个开放阅读框(ORF),分别编码复制酶(126KD/183KD蛋白)基因、移动蛋白(MP,30KD蛋白)基因和外壳蛋白(CP,17.5KD蛋白)基因,还有两端的两个非编码区。利用DNAMAN对所测序列与TMV-U1株系的核苷酸序列进行了比较,结果表明,所测序列包含三个完整的基因:TMV-RH MP基因全长为804nt,比TMV-U1株系缺少3个碱基,起始密码子为AUG,终止密码子为UAA,推测编码267个氨基酸,与TMV-U1株系的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为81.2%和84.6%; CP基因 ORF长度为480nt,起始密码子为AUG,终止密码子为UGA,推测编码159个氨基酸,与TMV U1株系CP基因的核苷酸同源性为86.5%,氨基酸同源性为94.3%;54KD蛋白的基因包括1503nt,起始密码子为AUG,终止密码子为UAA,推测编码499个氨基酸,与TMV U1株系的核苷酸同源性为85.6%,氨基酸同源性为95.8%。利用BLAST对CP、MP和54KD进行的分析表明,我们鉴定的TMV-RH MP基因的核苷酸序列与已发表的TMV其它株系MP基因的核苷酸序列的同源性在71.0%-81.2%之间,氨基酸序列同源性在72.6%-83.9%之间,与番茄花叶病毒(ToMV)MP基因的核苷酸同源性为71.0%,氨基酸序列同源性为72.6%;CP基因的核苷酸序列与已发表的TMV其它株系CP基因的核苷酸序列的同源性在 WP=9 76.3%-88.5%之间,氨基酸序列同源性在79.3%-95.0%之间,与番茄花叶病毒CP基因的核苷酸同源性为77.1%,氨基酸序列同源性为81.1%;54KD基因的核苷酸序列与已发表的TMV其它株系的核苷酸序列的同源性在81.6%-85.5%之间,氨基酸序列同源性在92.0%-100%之间,与番茄花叶病毒的核苷酸同源性为81.9%,氨基酸序列同源性为95.8%。不同株系MP、CP和54KD基因的核甘酸序列和氨基酸序列进化树分析结果也表明,TMV-RH可明显地划分为一个类型。由此我们推测TMV-RH可能为烟草花叶病毒的一个新株系。目前我们正在利用RACE法对TMV-RH基因组的5’端和3’端序列进行测定。 本文还针对TMV-RH 的CP基因设计引物,以感染TMV-RH的地黄叶片总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得TMV-RH CP基因的cDNA片段。将CP基因的cDNA片段连接到T载体上,得到含有完整CP基因的重组质粒pTCP。然后将CP基因通过中间载体 pJIT163克隆到双元植物表达载体pBinplus上,构建成功CP基因的植物表达载体pJBCP。利用CP基因的植物表达载体和我们以前获得的全长和缺失的MP基因的植物表达载体(pBMP-F和pBMP-D)在土壤农杆菌LBA4404(Rif+)介导下,以叶盘法分别转化本氏烟。经共培养和分化选择培养,共获得了40株再生植株。经PCR鉴定,其中36株能扩增出特异性目的片段,说明初步获得了转基因烟草植株。目前正在对烟草再生植株进行Southern杂交和Northern杂交以及抗病性鉴定。


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