猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究

【摘要】：从河南省某种育场采集丹系长自、法系长白、英系大白、法系大白猪肝组织,分别提取其基因组DNA,根据现有猪α干扰素基因序列设计引物,应用PCR技术直接从肝组织基因组中扩增猪α干扰素基因。将克隆得到的特异性片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞JM109,运用蓝白斑筛选、质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性可疑菌株,并将筛选的阳性可疑菌株送往宝生物工程(大连)有限公司测序。测序结果表明,得到了上述4个品系的猪α干扰素基因。用DNAstar序列分析软件对其进行同源性分析,核苷酸同源性均在97.2%以上,氨基酸同源性均在92.8%以上。 PCR扩增杂种猪α干扰素基因,将其克隆入克隆载体pGEM-T Easy中,得到一重组质粒pGEM-T-IFN-α Z。亚克隆猪α干扰素基因,将克隆的特异性片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了猪α干扰素原核表达载体pGEXIFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达,表达产物为一N-端带一GST的融合蛋白。SDS-PAGE电泳后在约45.0 kDa处出现了条带,其大小为GST分子量大小(26.0 kDa)和成熟猪α干扰素大小(约为19.0kDa)之和,具有特异性。用鼠抗猪IFN-α 1单克隆抗体作一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作二抗,Western blotting检测出现了特异性的条带。经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的18.6%。表达产物以包涵体形式存在。包涵体经变性、复性处理后,用细胞病变抑制法测定其活性,结果表明重组猪α干扰素在Vero细胞上抗VSV的活性为2.24×10~3U/mg。 重新合成一对引物,从重组克隆载体pGEM-T-IFN-α Z上亚克隆杂种猪α干扰素,并将其插入原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了猪α干扰素原核表达载体pETIFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达,表达产物为一N-端带一Nus·Tag融合标签的融合蛋白。SDS-PAGE电泳后在约85.0 kDa处出现了条带,其大小为Nus·Tag融合标签分子量大小(66.0 kDa)和成熟猪α干扰素大小(约为19.0 kDa)之和,具有特异性。用鼠抗猪IFN-α 1单克隆抗体作一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作二抗,Western-blotting检测出现了特异性的条带。SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在。经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%。