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烟草本塞姆氏(Nicotiana Benthamiana)中DREB转录因子的克隆及功能分析

王永亮  
【摘要】:干旱、高盐、低温等逆境胁迫是影响植物生长发育和品质形成的主要环境因素。在烟草农业生产中,由于烟苗移栽期的低温和苗期及烟株生长发育后期的干旱,对烟株生长发育和烟叶品质形成造成了不良影响,给烟农带来巨大的经济损失。长期以来为解决这一问题,烟草科技工作者从栽培和大田管理方面采取了许多措施,但收效甚微,只有从分子水平彻底改造烟株对非生物胁迫的适应性和耐受性,才能彻底解决这一问题。DREB转录因子可以调控烟草基因组中一系列抗非生物逆境胁迫的功能基因表达,增强烟株在逆境胁迫中的耐受性,因此对烟草中DREB转录因子基因的分离克隆及功能分析,将为采用分子生物学方法提高烟株的抗逆性奠定基础。本研究以野生烟草本塞姆氏(Nicotiana Benthamiana)品种为实验材料,从中分离克隆得到两个DREB类转录因子基因,并对其功能进行分析,发现了烟草中DREBP与DRE顺式元件结合的关键氨基酸。主要研究内容如下: 1.通过从GenBank获取得到的EST序列分析,利用分子生物学技术从烟草中克隆得到具有AP2/EREBP结构域特征的NbDREB1和NbDREB2两个基因。将NbDREB1和NbDREB2基因插入YepGAP酵母单杂交载体进行功能检测,发现两个基因的WDRE型酵母转化体均不能在含有0.03 mol/L 3-AT的SD/His~-Ura~-Trp~-平板上生长;进一步将NbDREB1和NbDREB2基因插入到酵母单杂交载体pGADT7中做反式激活检测,结果显示只有NbDREB1/pGADT7重组体能在含有0.03 mol/L 3-AT的SD/His~-Ura~-Trp~-平板上生长,并激活β-galactosidase报告基因表达。表明NbDREB1能特异结合DRE顺式作用元件,但不具有调节转录功能。 2.分析NbDREB1和NbDREB2基因的AP2区,发现NbDREB1的49位K和NbDREB2的49位R同为碱性氨基酸,性质相近;而NbDREB1第2位Y和NbDREB2第2位N一个为芳香族氨基酸、一个为中性氨基酸,性质上差别较大。因此,选定在NbDREB1和NbDREB2基因的AP2区第二位氨基酸处进行点突变。突变后的AP2区插入酵母单杂交载体pGADT7进行功能检测,NbDREB2第二位氨基酸N突变成Y后能在含有0.03 mol/L 3-AT的SD/His~-Ura~-Trp~-平板上生长,并激活β-galactosidase报告基因表达;而NbDREB1的第二位氨基酸Y突变成N后失去了与DRE元件结合的能力。表明烟草DREB类转录因子AP2区的第2位酪氨酸残基(Y)是识别并结合DRE顺式元件的关键氨基酸。


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