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家禽β-防御素基因的克隆、原核表达及活性鉴定

石建州  
【摘要】: 防御素是动物和植物体内抗感染及激发特异性抗感染免疫的重要抗菌肽。Gallinacin-4(Gal-4)是禽类体内重要的β-防御素。本试验主要是对不同禽类β-防御素基因的克隆、原核表达及其生物活性的鉴定。 1、参照Genbank已发表的NM001001610(Gallinacin-4)序列,由其成熟肽片断(CDS除去signal peptide和propiece)设计引物,从红羽丝毛乌骨鸡、固始鸭、固始鹅、鸵鸟、鸽的骨髓中提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增出大小约为117bp的基因片段,并把它克隆到pUCm-T Vector上,构建重组质粒pUCm-Gal-4,经PCR、酶切鉴定及DNA测序验证,该基因Gal-4为编码序列,比较表明:五个品种Gal-4基因序列及推导氨基酸序列均为117bp,编码38个氨基酸,同源性达到100%;与AY621319报告的Gal-4基因序列完全符合,与NM001001610序列有一个碱基不同。分别登录注册Genbank。登录号为:红羽丝毛乌鸡DQ673442、鸽子DQ860106、鸵鸟EF031035、固始鸭EF606702、固始鹅EF606703。Gal-4基因的克隆成功为进一步研究禽类的β—防御素基因功能和应用奠定了基础。 2、分析Gal-4成熟肽基因序列117bp(含一个终止密码子),含有5个稀有密码子用原核常用的密码子替换,重新合成117bp基因,其氨基酸仍为原来氨基酸序列。在以上基础上,我们把新合成的基因片段分别引入BamHI、HindⅢ酶切位点,亚克隆到同样双酶切的大肠杆菌原核表达载体pGEX-4T-1(BamHI和HindⅢ)中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Gal-4,经PCR、酶切鉴定并进行确证性序列鉴定,结果表明,将Gal-4的基因正确地插入到原核表达载体pGLX-4T-1的目的位点,重组质粒pGEX-4T-1-Gal-4转化受体菌BL21(DE3)PlySs中,用IPTG诱导,经SDS-PAGE电泳显示,pGLX-4T-1-Gal-4表达产物分子质量约为30KDa,与理论推测的蛋白分子质量基本一致,进一步优化表达条件,1.0mmol/L IPTG在37℃诱导4小时条件下,表达量最大。 3、重组蛋白的变性、复性研究。考虑到降解和表达产物对宿主菌的毒性作用的影响,用1.0mmol/L IPTG在37℃诱导4小时和25℃诱导2小时,其融合蛋白粗提物进行微量琼脂糖弥散法测定这种防御素的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和真菌(白色念珠菌)均无的抑制作用。其防御素的原核表达有待于进一步研究探讨。


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