植酸酶基因在pIAβ8和pGAPZαA两种载体中的表达及酶学特性分析

【摘要】： 本研究旨在测定无花果曲霉植酸酶的酶学特性,克隆出无花果曲霉植酸酶的基因,构建原核和真核重组表达载体,比较两种重组表达载体在大肠杆菌中表达分泌的植酸酶酶活,从而选择最佳表达载体,为进一步生产转基因植酸酶奠定基础。 无花果曲霉采用麸皮固体培养基发酵,利用生理盐水浸提植酸酶,通过离心、盐析、透析、层析纯化回收无花果曲霉植酸酶并测定其酶学特性。结果表明,其最适pH为2.5和5.5,最适合温度为50℃,该特性对于其作为饲料添加剂,被单胃动物利用降解植物性饲料中的植酸非常有利。 本试验成功提取了无花果曲霉的基因组DNA,设计引物,利用PCR扩增出植酸酶的基因片段(1.4Kb),纯化回收目的基因,并克隆到克隆载体PUCm-T中。经PCR检测,XbaⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定及DNA测序,证实插入片段的DNA序列与Genebank中已公布的植酸酶(Ref AY013315)成熟肽目标序列同源性达99.53%,克隆序列编码蛋白与目的序列的同源性为99.63%,且完整保留了酸性磷酸酶的活性中心编码蛋白序列。本次克隆的植酸酶基因序列已在Genebank上注册(Ref.EF206311)。 将植酸酶基因从克隆重组表达载体上双酶切下来,与双酶切过的原核表达载体pIAβ8相连接。经PCR检测、酶切鉴定及表达的植酸酶活性测定,验证了植酸酶基因完整准确地插入原核表达载体中。同样地成功构建了pGAPZαA-phyA重组表达载体。通过两种重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶酶活比较,可得出pIAβ8-phyA重组表达载体可分泌表达胞内植酸酶(9.04 U/ml,P＜0.05);而pGAPZαA-phyA重组表达载体可分泌表达胞外植酸酶(8.04 U/ml,P＜0.05)。SDS-PAGE电泳检测出两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中可表达植酸酶蛋白,在54.61 KDa处均有亮带,且与商品植酸酶的位置相当。