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感染猪的肠球菌生物学特性研究

程金平  
【摘要】: 肠球菌为球形或卵圆形、呈链状排列的革兰阳性细菌,自从1984年单独成属以来,已由原来的两个种增加到41个种。肠球菌不但可引起医院内病人的腹膜炎、心内膜炎、尿道炎和脑膜炎等,也可引起猪、羊、鸡和鸭等动物的感染,感染动物的肠球菌也可直接传染给人,污染食品中的肠球菌也可导致人的食物中毒,因此肠球菌在公共卫生学上具有重要的意义。2003~2007年期间,在河南省许昌、南阳、郑州、洛阳等地患有败血症、脑膜炎和关节炎的病猪体内分离到42株疑似肠球菌,对其进行了常规的形态学观察、耐受性试验、生化鉴定和全细胞蛋白型分析,并进行了16S rRNA和RAPD等分子水平探讨,以期为进一步研究感染猪的肠球菌多样性及猪源肠球菌感染的临床治疗和公共卫生学意义提供参考依据。 42株分离菌全呈G+,卵圆形或球形,并呈长短不一的链状排列,能够在6.5%NaCl肉汤、pH 9.6葡萄糖肉汤、10℃、45℃和60℃30 min条件下生长。Vitek-32全自动细菌鉴定系统对42株中的34株成功进行了鉴定,鉴定率81.0 %,其中粪肠球菌(E. faecalis)10株、屎肠球菌(E. faecium)2株、铅黄肠球菌(E. casseliflavus)22株,另有8株分离菌未鉴定到种的水平;细菌全细胞蛋白型分析结果表明,42株分离菌全细胞蛋白条带呈现出两种完全不同的聚类型,据此可将42株分离菌分为两种类型,两种类型电泳条带的分子量差异主要在97KDa、90KDa、67KDa和46KDa处,一种类型具有蛋白分子量90 KDa的条带,而另一种类型则具有46KDa、67 KDa和97 KDa 3个条带,因此,90KDa条带和46KDa、67 KDa和97 KDa 3个条带可作为这两种类型肠球菌的特征性区别条带。 16S rRNA基因序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法。我们采用细菌通用16S rRNA引物对42株感染猪的肠球菌16S rRNA全基因进行扩增,扩增产物克隆到pTG19-T载体中进行测序,所得序列用BLAST软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列比较,结果表明42株肠球菌的16S rRNA序列与GenBank中登录的各种肠球菌同源性较高。利用DNAStar软件将42株感染猪的肠球菌与GenBank中32种肠球菌的16S rRNA序列进行序列同源性分析,42株分离菌均鉴定到种的水平,其中12株感染猪的肠球菌与GenBank中登录的4株粪肠球菌(E.faecalis)模式菌株(AF515223、AJ301831、EU728747、NC_004668)的同源性在99.3%~99.9%之间;30株感染猪的肠球菌与GenBank中登录的3株屎肠球菌(E.faecium)模式菌株(EU547780、DQ411813、Y18294)的同源性在99.3%~100%之间。同时,我们测定的42株肠球菌(HN-N1~HN-N42)16S rRNA序列已被GenBank收录,按菌株顺序其登录序列号(accession number)分别为为FJ378656~FJ378697。与已公布的肠球菌种特异性探针序列相比较,42株肠球菌16S rRNA基因序列均含有屎肠球菌和粪肠球菌种特异性探针序列。 利用19条随机引物以随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对42株分离菌进行了鉴别。结果表明,有4条引物对所有菌株扩增均得到多态性较好的条带,每株菌DNA扩增条带数在1~10条之间,不同菌株所得的片段大小介于200~4000bp之间,4条引物扩增42个菌株共观察到673条清晰的带纹,每条引物平均产生168.3个扩增片断,每株肠球菌平均产生4个扩增片断。SPSS13.0软件计算其相似性系数和遗传距离指数,利用最短距离法绘制系统发育树。结果显示,HN-N3和HN-N6两菌株间遗传距离指数为0.000,推测其可能为同源株。在聚类重新标定距离(rescaled distance cluster combine)为23的水平上,42株肠球菌可分为两大聚类群,这与16S rRNA的鉴定结果完全一致,这说明聚类重新标定距离23可以进行肠球菌种的鉴定;30株屎肠球菌在聚类重新标定距离为16的水平上分为9大聚类群;12株粪肠球菌与3株粪肠球菌阳性参考菌株(ATCC29212、ATCC33186、CMCC(B)32223)在在聚类重新标定距离为19的水平上分为4大聚类群。


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