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重灸对失眠模型大鼠脑组织Prepro-orexin、Orexin-A影响的研究

蒋西玲  
【摘要】:目的:通过重灸干预疗失眠模型大鼠,检测其脑组织中Prepro-orexin及Orexin-A的阳性细胞表达,探讨重灸在治疗失眠中的作用,为临床提供依据。方法:实验共选取40只雄性健康SD清洁级大鼠(200±10g),正常喂养7天,观察显示一切正常后,进入实验阶段:对每只大鼠称量体重并记录,采用完全随机法将大鼠分为空白对照组(A组)、模型对照组(B组)、重灸治疗组(C组)、针刺治疗组(D组)和温和灸治疗组(E组)。在上午8点,对空白对照组(A组)大鼠不做任何处理,对模型对照组(B组)、重灸治疗组(C组)、针刺治疗组(D组)和温和灸治疗组(E组)四组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸混悬液(PCPA),按lml/100g的剂量,连续注射2天。观察大鼠行为睡眠节律改变情况,待模型制备成功后分别对五组大鼠称取重量,记录并采取以下干预手段:空白对照组(A组):不采取任何干预方法;模型对照组:不做其他干预治疗;重灸治疗组:剔除大鼠背俞穴位置毛发,将大鼠放于特制鼠笼中,涂抹大蒜汁刺激并进行重灸干预,以灸出灸斑为止;针刺治疗组:剔除背俞穴位置毛发,在双侧“心俞”、“脾俞”、“肾俞”位置进行针刺,连续治疗6天;温和灸治疗组:剔除大鼠背俞穴位置毛发,在距离背俞穴位置2cm的位置进行温和灸处理,每次艾灸10min,共治疗6天。干预治疗6天后取材:在清洁冰盘上,固定大鼠颅骨,用小镊子迅速撬开颅骨细心剥离出大鼠脑组织,放在标记好的4%对聚甲醛中等待下一步处理。?HE染色观察大鼠脑组织细胞及细胞核的形态。?利用免疫组化方法进行不同组间的Prepro-orexin、Orexin-A蛋白进行检测,观察阳性细胞光密度值。结果:1.(1)大鼠行为学改变:实验前7天,五组动物食欲、精神、生长、发育、毛色、毛形及反应灵敏度均正常。首次注射PCPA24~36小时候,出现昼夜节律紊乱,大鼠活动频繁,部分躁动不安,通过对比观察。和空白对照组差异明显,显示造模成功。(2)体重的比较:通过对各组大鼠首次造模前当天、首次治疗前当天、取材前当天体重的观察比较发现:首次造模前:各组大鼠体重平稳,各组间无统计学意义(P0.05)。首次治疗前:模型对照组(B组)与空白对照组(A组)比较,有明显差异(P0.05)。取材前:重灸治疗组(C组)可使PCPA所致失眠模型大鼠下降的体重明显上升,和模型对照组(B组)比较差异明显(P0.05)。针刺治疗组(D组)可使PCPA所致失眠模型大鼠下降的体重明显上升,和模型对照组(B组)比较差异明显(P0.05)。与重灸组体重结果相比有显著差异(P0.05)。温和灸治疗组(E组)可使PCPA所致失眠模型大鼠下降的体重明显上升,和模型对照组(B组)比较差异明显(P0.05)。与重灸治疗组(C组)比较差异明显(P0.05),与针刺治疗组(D组)比较无明显差异(P0.05)。2.HE染色结果:空白对照组(A组)大鼠下丘脑神经细胞清晰完整,排列整齐密集,神经元细胞胞浆非常丰富。模型对照组(B组)大鼠下丘脑细胞形态改变严重,大量细胞出现空泡现象,排列疏松,细胞界限表现模糊,细胞核皱缩;重灸治疗组(C组)下丘脑核团细胞大量恢复,细胞排列较整齐,细胞空泡明显减少;针刺治疗组(D组)下丘脑核团排列疏松,仍有少量空泡现象,偶见萎缩细胞,细胞界限模糊;温和灸治疗组(E组)下丘脑核团细胞排列疏松,部分细胞变形严重,细胞周围间隙大,部分水肿。3.Prepro-orexin免疫阳性细胞光密度值:prepro-orexin免疫阳性细胞主要分布在下丘脑外侧区和下丘脑穹窿周围核,染色后呈现棕黄色,空白对照组(A组)和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05),说明模型制备成功。重灸治疗组(C组)可使失眠模型大鼠脑组织中的Prepro-orexin含量降低,和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05);针刺治疗组(D组)可使失眠模型大鼠脑组织中的Prepro-orexin含量降低,和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05),与重灸治疗组(C组)所测光密度值比较有明显差异(P0.05);温和灸治疗组(E组)可使失眠模型大鼠脑组织中的Prepro-orexin含量降低,和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05);与重灸治疗组(C组)所测光密度值比较有明显差异(P0.05),与针刺治疗组(D组)所测光密度值比较,有明显差异(P0.05)。Orexin-A阳性细胞免疫组化光密度值:对各组样本脑组织的多部位免疫组化切片实验表明,在脑组织的Orexin-A外侧下丘脑和穹窿周围核位置可见成片的棕黄色染色,在脑室的其他区域已有少量弱阳性表达。空白对照组(A组)和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05),说明模型制备成功。重灸治疗组(C组)可使失眠模型大鼠脑组织中的Orexin-A含量降低,和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05);针刺治疗组(D组)可使失眠模型大鼠脑组织中的Orexin-A含量降低,和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05),与重灸治疗组(C组)所测光密度值比较有明显差异(P0.05);温和灸治疗组(E组)可使失眠模型大鼠脑组织中的Orexin-A含量降低,和模型对照组(B组)比较,有明显差异(P0.05);与重灸治疗组(C组)所测光密度值比较有明显差异(P0.05),与针刺治疗组(D组)所测光密度值比较,有明显差异(P0.05)。结论:1.PCPA法可成功复制失眠大鼠模型。2.造模成功后大鼠体重下降,重灸法对失眠大鼠的体重调节最为明显。3.睡眠-觉醒的调节与Prepro-orexin、Orexin-A的表达相关。重灸法可使失眠模型大鼠脑组织中Prepro-orexin、Orexin-A含量增加,对失眠起到调节作用。


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