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脑脉通联合骨髓干细胞动员剂对脑缺血大鼠神经细胞凋亡的影响

田玉收  
【摘要】: 目的:以脑缺血损伤大鼠为研究对象,通过外周血及脑组织中CD34+细胞的变化,观察骨髓干细胞动员的效果;通过观察脑缺血损伤后大鼠不同时间点神经功能、脑组织含水量、脑梗死面积、脑组织病理的动态变化,探讨脑脉通联合骨髓干细胞动员剂对脑缺血后神经细胞损伤的保护作用;通过观察脑缺血损伤后神经细胞凋亡及相关凋亡调控基因表达的变化,揭示脑脉通和骨髓干细胞动员剂及其联合应用对脑缺血损伤后的保护作用及其可能的作用机制。 方法:本研究以SD大鼠为研究对象,按随机数字表法分为假手术组、模型组、骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)动员组(简称动员组)、脑脉通组、BMSCs动员联合脑脉通组(简称联合组),根据取材时间点各分为2d、3d、7d、14d组。栓线阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型;假手术组、模型组、动员组分别于造模前4天用生理盐水灌胃,每天1次,造模前加灌胃1次,术后每日灌胃1次直至取材(灌胃容积为1ml?100g-1?d-1);脑脉通组和联合组分别于造模前4天用脑脉通灌胃,每天1次,造模前加灌1次,术后每日灌胃1次直至取材(具体用量为40.5mg?100g-1?d-1,40.5mg?ml-1)。动员组和联合组大鼠分别于造模前3天皮下注射粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF),术后皮下注射2天,每天1次。观察大鼠外周血白细胞计数(white blood cell,WBC),血液及脑组织CD34+变化,观察大鼠存活与体重变化情况,对大鼠进行神经功能综合评测,测定和计算大鼠脑组织含水量和脑梗死面积,光镜下观察脑组织病理改变,透射电子显微镜观察细胞超微结构变化,TUNEL法观察神经细胞凋亡,免疫组织化学法观察Bcl-2,Bax,Fas,FasL,Caspase-3表达的变化。 结果:①与假手术组比较,模型2d、3d大鼠外周血中WBC、CD34+细胞数量显著增多,3d达到峰值,随后逐渐下降。与模型组比较,动员和联合组2d、3d的WBC、CD34+细胞数量显著增多,以3d尤为显著,脑脉通组无显著变化。联合组2d、3d较动员组WBC计数显著增高,联合组7d大鼠外周血WBC仍维持较高水平,联合3d、7d组大鼠外周血中CD34+细胞数量较动员组显著升高。②假手术组脑组织中没有检测到CD34+表达。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织CD34+细胞表达均显著升高,7d达到峰值,随后逐渐降低。与模型组比较,动员各组和联合各组CD34+表达均显著升高,以联合组7d尤为显著,脑脉通组脑组织CD34+细胞表达无显著变化。与脑脉通组相比,动员组脑组织CD34+细胞表达显著升高。联合组脑组织CD34+细胞表达较脑脉通组、动员组显著升高,以联合7d组尤为显著。③与假手术组比较,模型组大鼠死亡率显著增高,2d、3d、7d体重下降率显著增加、14d体重增长率显著降低,神经功能评分显著降低,脑组织含水量增多,脑梗死面积扩大。病理观察假手术组未见明显病理损伤,模型组各时间点神经细胞有不同程度的损伤和结构破坏,以模型7d组最重。与模型组比较,脑脉通组2d、7d和动员组3d及联合组2d、3d、7d体重下降减少,各14d组体重增长率显著提高,神经功能评分显著增高,脑组织含水量显著降低,脑梗塞面积显著减少,脑组织病理损伤破坏减轻。与脑脉通组和动员组比较,联合组作用更为显著,以14d组最为明显。随着缺血再灌注时间的延长,大鼠神经功能损伤以2d最为严重,其后随时间延长逐渐恢复,脑组织含水量及脑梗塞面积则以7d最为严重,14d时有所减轻,神经细胞损伤以7d最为严重,至14d时有所减轻。光电镜病理观察脑脉通组和动员组及联合组神经细胞变性、坏死数量明显减少,间质水肿较轻,以联合14d组损伤最轻。④模型组大鼠较假手术组神经细胞凋亡增多,脑脉通组2d、14d、动员组2d、3d和联合组2d、3d和14d神经细胞凋亡较模型组明显减少,脑脉通14d组神经细胞凋亡较动员组明显减少,动员组2d和脑脉通组2d、3d神经细胞凋亡较联合组明显增多。模型组、脑脉通组、动员组和联合组2d神经细胞凋亡最严重。⑤模型组大鼠较假手术组Fas、FasL表达显著增强,脑脉通7d、14d组、动员2d组、联合各组较模型组减弱显著,动员组2d较脑脉通组Fas、FasL表达显著增多。模型、脑脉通、联合7d、14d组和动员14d组分别较其2d组的Fas、FasL表达显著减弱,各14d组较其3d组Fas、FasL表达均显著减弱。⑥模型组大鼠较假手术组Bcl-2、Bax表达显著增多,脑脉通14d组、联合3d、7d、14d组Bcl-2表达较模型组显著增多,脑脉通7d组、动员3d、7d组、联合各组Bax表达显著减弱。脑脉通14d组较动员组Bcl-2表达显著增多。各14d组较其2d、3d组Bax表达显著减少。⑦模型组大鼠较假手术组Caspase-3阳性表达显著增强,脑脉通7d、14d组和联合各组较模型组Caspase-3表达显著降低。模型组、动员组和脑脉通组7d、14d及联合3d、7d、14d组Caspase-3表达较其2d均有显著减少,脑脉通7d、14d组较其3d表达减少显著,模型组、动员组14d表达较其3d组的Caspase-3表达减少。 结论:①G-CSF具有显著的骨髓干细胞动员作用,促进血液及脑组织中CD34+显著增多,脑脉通能够改善BMSCs动员的微环境,促进BMSCs动员。其联合用药效果更为显著,且作用时间较长。②大鼠脑缺血损伤后死亡率增高、体重下降率增多、增长率减少,神经功能缺损、脑组织水肿、梗塞灶形成和神经细胞受损,以7d最为严重,可随脑缺血时间延长有不同程度恢复。脑脉通、BMSCs动员及其联合应用对大鼠脑缺血损伤有明显的保护作用,并随时间的延长作用呈增强趋势,其中以联合14d的作用尤为明显。③脑缺血损伤引起神经细胞凋亡,表现为大量神经细胞凋亡,Caspase-3、Fas、FasL表达增高,Bcl-2、Bax表达增高,以Bax增高为主。脑脉通、BMSCs动员及其联合应用能减少神经细胞凋亡数,对抑凋亡基因Bcl-2的表达有上调作用,下调促凋亡基因Fas、FasL、Bax和Caspase-3的表达;其联合应用疗效更显著。


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