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不同途径移植人脐带间充质干细胞治疗糖尿病大鼠的实验研究

张迪  
【摘要】:背景糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)发病率逐年攀升,严重影响人们的健康和生活质量。糖尿病发病的共同特点是胰岛p细胞的减少。促进p细胞再生成为糖尿病治疗的新思路。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)具有自我更新和多向分化的能力,大量研究表明,移植hUCMSCs能明显减低糖尿病受鼠的血糖水平,使其成为β细胞替代的新资源。然而,移植位点为移植物存活和发挥作用提供必要的场所,只有当移植物能够稳定定植和长期存活,移植才可能成功,治疗才有意义。目前,干细胞体内移植途径多种多样,移植效果参差不一,关于最理想的移植部位尚无一致的报道。另外,虽然目前hUCMSCs的治疗作用得到普遍认同,但其降糖作用机理仍不十分清楚,对其到底能否转分化为p细胞也存在较大争议。 目的建立以p细胞破坏为特征的1型糖尿病大鼠模型,观察不同部位移植hUCMSCs后的降糖效果,即受鼠血糖、血胰岛素浓度等指标的变化以及胰腺组织病理学变化,探讨最理想的移植部位。同时通过检测移植后受鼠胰腺内鼠及人insulin、 PDX-1、nestin mRNA的表达量,探讨hUCMSCs是否转分化为p细胞及其修复受损胰岛、降低受鼠血糖的可能机制。 方法(1)清洁级正常成年雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠70只,7周龄,体重230-250g,普通标准饲料适应性喂养2周后,随机分为正常对照组(NC组,n=10);糖尿病模型组(STZ组,n=60)。STZ组大鼠空腹12小时后,按70mg/kg的剂量单次腹腔注射1%链脲佐菌素溶液,制作1型糖尿病大鼠模型。各只大鼠分别于注射前、注射后48h、5d、8d、11d、14d时间点尾静脉采血,测定全血随机血糖浓度。将注射后随机血糖持续稳定16.7mmol/L的大鼠定为成模大鼠,血糖不达标者剔除出组。 (2)STZ注射2周后,将成模大鼠(n=56)随机分配到各实验组:胰腺被膜下移植组(Pan组,胰腺被膜下多点注射hUCMSCs, n=14)、肾被膜下移植组(Nep组,左肾被膜下注射hUCMSCs, n=14)、肝内移植组(Hep组,肝实质内多点注射hUCMSCs, n=14)和糖尿病模型对照组(DMC组,胰腺被膜下多点注射生理盐水,n=14)。各组大鼠均以2%异戊巴比妥钠(50mg/kg)溶液腹腔注射麻醉,固定后打开腹腔,各干细胞移植组分别按要求于移植部位注射0.5m1生理盐水重悬后的hUCMSCs(细胞数量1×106个);DMC组及NC组大鼠则于胰腺被膜下注射不含任何细胞的生理盐水0.5m1。移植后各组大鼠饮食同前,观察6周,观察期间注意大鼠存活状况、一般情况变化,每周同一时间段称量体质量(BW)一次,尾静脉采血测空腹血糖(FBG)一次,眶下静脉丛采血测空腹胰岛素(FINS)浓度一次。 (3) hUCMSCs移植6周后,各组大鼠以2%异戊巴比妥钠(50mg/kg)溶液腹腔注射麻醉。采用心脏灌注方法固定后取大鼠胰腺、肾脏、肝脏组织,4%多聚甲醛固定48h。制作石蜡切片,HE染色观察胰腺组织形态学变化以及移植部位组织中有无新生细胞团,免疫组织化学染色方法测定胰腺组织内鼠及人胰岛素的表达。另取组织采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)法检测胰腺内鼠及人insulin、PDX-1、estin mRNA的相对表达量。 (4)实验结果的统计学分析采用SPSS13.0软件进行,正态性检验α取0.2为检验水准,以均数士标准差(x±s)表示实验结果。重复测量数据多个干预组间均数的比较采用方差分析,组间两两比较采用最小显著性差(LSD)检验,多个时间点前后比较与交互作用采用方差分析,P0.05为差异有统计学意义。 结果(1)STZ组大鼠造模后2周,随机血糖明显升高(21.0±6.9mmol/l),与NC组(7.0±1.3mmol/l)相比,差异有统计学意义(P0.05)。 (2)各组手术过程顺利,术后大鼠伤口愈合、存活良好。干细胞移植后,与NC组比较,DMC组、Pan组、Nep组、Hep组大鼠体质量始终偏低,差异有统计学意义(P0.05);与DMC组比较,Pan组大鼠于移植后第3周开始出现体质量增长趋势,并持续至实验结束时,差异有统计学意义(P0.05);Nep组及Hep组大鼠体质量增加不明显。 干细胞移植后,与NC组比较,DMC组、Pan组、Nep组、Hep组FBG水平始终较高,而FINS水平始终较低,差异均有统计学意义(P0.05)。与DMC组比较,Pan组大鼠自移植后第2周开始FBG出现显著下降,而FINS浓度明显上升,并持续至实验结束时,差异有统计学意义(P0.05)。Nep组大鼠于移植后第3周出现FBG下降,FINS水平上升,并维持至第5周末,自第6周开始,FBG出现再次回升,而FINS水平下降,与DMC组比较,差异无统计学意义(P0.05)。Hep组大鼠于移植后第2周FBG开始下降,FINS开始上升,并持续至第4周末,第5周末复查时,FBG出现回升,FINS水平回落,与DMC组比较,差异无统计学意义(P0.05)。 (3)组织病理学检查:胰腺移植组大鼠胰腺萎缩,组织切片可见胰岛萎缩,数量减少,但胰腺内可见大量由幼稚细胞构成的细胞团,团内细胞核大,胞浆淡染,行鼠insulin免疫组化染色可见阳性染色,而肝内移植组的大鼠肝脏及肾包膜下移植组的肾脏均未见外源性细胞团形成。 免疫组化染色结果:DMC组、Pan组、Nep组、Hep组鼠胰岛素染色平均光密度较NC组显著降低,差异有统计学意义(P0.05);Pan组平均光密度与DMC组比较,明显升高,差异有统计学意义(P0.05);Nep组、Hep组平均光密度与DMC组比较,差异无统计学意义(P0.05)。所有组织切片均未检测到人胰岛素的表达。 (4) RT-PCR检测结果显示:NC组、DMC组、Pan组大鼠胰腺组织内均未表达人insulin mRNA,同时也无人PDX-1、nestin mRNA表达。Pan组大鼠胰腺内鼠insulin mRNA表达量虽仍低于NC组(P0.05),但明显高于DMC组(P0.05)。而鼠PDX-1、鼠nestin mRNA表达量均高于NC组(P0.05),同时高于DMC组(P0.05)。 结论1.大剂量STZ单次腹腔注射可成功构建1型糖尿病大鼠模型;2.hUCMSCs移植可降低受鼠血糖水平,胰腺被膜下是最佳的移植部位;3.hUCMSCs不是通过直接转分化为p细胞来降低受鼠血糖,而可能是通过促进内源性胰腺干细胞增殖、分化来发挥作用的。


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