红鳍东方鲀SREBP基因的克隆及表达研究

【摘要】：背景脂肪组织是动物体内最大的能量储存场所,在体内能量平衡中起关键作用,脂肪组织发育失衡往往引发诸多健康问题。目前,对脂肪组织发育及其调控的研究在人类医学和农业科学领域均备受关注。鱼类的肉质和脂肪沉积的调控是水产学科研究中的重要内容。鱼类脂肪沉积的主要部位是肝脏、骨骼肌和脂肪组织。脂肪沉积的部位可能是由组织特异的脂肪代谢通路决定的,而其通路在分子水平上由关键的酶和基因参与调控。固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding protein,SREBP)是真核细胞内调节脂肪代谢的关键转录因子。目的获得红鳍东方鲀SREBP基因的序列,检测其组织表达特征。构建红鳍东方鲀SREBP-1基因的原核表达载体并进行蛋白的表达及纯化。方法1.采集红鳍东方鲍肝脏组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀SREBP基因的ORF,并利用生物信息学方法对序列进行分析。2.利用real time RT-PCR技术检测SREBP-1在不同组织的表达情况。3.构建原核表达载体PET-32/SREBP-1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经IPTG诱导后进行融合蛋白表达,Western blot鉴定表达产物。结果1.分析红鳍东方鲀SREBP-1基因的序列及组织表达特性获得红鳍东方鲀SREBP-1基因ORF区的cDNA序列,长度为3330bp,编码由1109个aa组成,蛋白质分子量为119.94ku,等电点为8.37。其氨基酸序列与黄斑蓝子鱼的同源性最高为81%、与人及原鸡的同源性较低为54%。分子进化分析显示红鳍东方鲀SREBP-1氨基酸序列与蓝子鱼的亲缘关系最近。组织表达特征分析结果显示,SREBP-1在红鳍东方纯的脑组织中表达丰度最高,其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏,在肌肉中表丰度最低。2.成功获得pET-32a(+)/SREBP-1重组质粒设计一对包含红鳍东方纯SREBP-1基因ORF区并带有双酶切位点的引物,PCR后克隆到pET-32a(+)原核表达载体,进行双酶切与测序双重鉴定,证实成功获得了pET-32a(+)/SREBP-1重组质粒。3.在大肠杆菌中的成功表达pET-32a(+)/SREBP-1重组质粒将获得的重组质粒pET-32a(+)/SREBP-1转化入大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞,经1.0Mm IPTG,30℃5h诱导表达,利用SDS-PAGE电泳检测发现融合蛋白分子量为141 ku左右,与预测的分子量一致。4.纯化及鉴定重组蛋白pET-32a(+)/SREBP-1超声波离心后进行上清的收集,然后用纯化柱(6×His Ni-NTA)进行纯化并收集蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot技术进行鉴定发现在141 ku出现目的条带,证明已纯化得到融合蛋白为目的蛋白SREBP-1。结论本研究成功获得了红鳍东方鲀SREBP基因的完整的ORF序列,并对SREBP-1基因的组织表达特性进行了分析,构建了pET-32a/SREBP-1重组质粒。