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酒依赖大鼠海马脑区的miRNA和mRNA表达分析及miR-96-5p靶基因与功能验证

杨彬  
【摘要】:背景近年来,酒依赖相关miRNA调控研究逐渐成为热点。大多数基因受miRNA调控,miRNA在脑组织中表达丰富,参与如神经元增殖、分化、突触的形成和可塑性等过程,并影响物质依赖引起的细胞适应性。研究发现,大鼠过度摄取酒精后诱导miRNA表达异常,通过调节多种神经递质相关蛋白及营养因子等进而调节酒依赖的形成,并在临床或行为表征(渴求、戒断、复饮、认知损害等)演变中起重要的调节作用。但miRNA及靶基因在酒依赖的形成和临床表征演变中的作用仍需进一步明确。目的筛选酒依赖模型大鼠海马脑区中差异表达的miRNA和mRNA,并验证miRNA对靶基因的调控作用。探究miR-96-5p调控Tp73作用,进一步研究miR-96-5p对神经细胞凋亡的影响。方法1.提取酒依赖组大鼠(n=6)和对照组大鼠(n=6)海马脑区总RNA,并采用高通量测序法进行miRNA和mRNA测序,筛选出差异表达基因,通过生物信息学手段分析二者的关联性,构建miRNA-mRNA负调控网络。2.利用NCBI、GCBI等数据库,筛选酒依赖大鼠海马脑区中差异表达的mRNA,结合构建的miRNA-mRNA负调控网络,并利用miRWalk等软件预测miRNA,筛选miRNA-mRNA。3.在组织水平,利用实时荧光定量PCR技术验证筛选的mRNA和miRNA表达情况。4.miRNA mimic/inhibitor干预PC12细胞,通过实时荧光定量PCR技术从细胞水平验证miRNA对mRNA的靶向调控作用。5.利用Western Blot检测miR-96-5p干预后的Tp73蛋白水平,利用双荧光素酶报告基因实验检测miR-96-5p对Tp73的3’端非翻译区结合情况,验证miR-96-5p对Tp73的靶向调控作用。6.设置miR-96-5p inhibitor转染浓度梯度和转染时间梯度,利用CCK-8试剂盒分别检测PC12细胞转染后的存活率变化情况。7.采用流式细胞实验,检测miR-96-5p inhibitor转染对PC12细胞凋亡的影响。结果1.酒依赖大鼠海马脑区高通量测序结果:mRNA显著差异表达总数47个,其中上调16个,下调31个;miRNA显著差异表达总数38个,其中上调4个,下调34个,并进一步对mRNA和miRNA的测序结果进行分析,构建miRNA-mRNA负调控网络(P均0.05)。2.筛选出与酒依赖、物质成瘾、神经发育、神经细胞凋亡等可能相关基因,如Clic6、Tp73、Pla2g3、Ak7、Gli1、Cckbr和miR-6215、miR-183-5p、miR-96-5p、miR-196a-5p、miR-206-3p、miR-34b-3p,并在酒依赖大鼠海马组织中,验证基因表达水平,实时荧光定量PCR实验结果与测序结果基本一致(P均0.05)。3.利用miRNA mimic/inhibitor干预细胞,模拟miRNA在酒依赖大鼠海马脑区中的表达水平,上调/下调miRNA,实时荧光定量PCR结果显示miR-96-5p inhibitor预测靶基因Tp73表达上调、miR-34b-3p mimic预测靶基因Cckbr表达下调,初步证实上述两组miRNA-mRNA的靶向调控作用(P均0.05)。4.转染miR-96-5p inhibitor后,Tp73蛋白表达量明显高于对照组。双荧光素酶报告基因实验中,与对照组相比,转染了miR-96-5p mimic后,野生型载体r-Tp73-WT的报告荧光出现了明显的下调;对其预测靶位点进行突变后,突变型载体r-Tp73-MUT中的报告荧光出现了明显的回升(P均0.05)。5.在不同转染浓度和不同转染时间下,miR-96-5p inhibitor转染组细胞的存活率小于对照组;与对照组相比,miR-96-5p inhibitor转染组PC12细胞凋亡数目增加(P均0.05)。结论1.miR-6215、miR-183-5p、miR-96-5p、miR-196a-5p、miR-206-3p、miR-34b-3p和Clic6、Tp73、Pla2g3、Ak7、Gli1、Cckbr在酒依赖模型大鼠海马脑区中差异表达。2.初步验证了miR-96-5p和Tp73、miR-34b-3p和Cckbr靶向调控关系,进一步验证了miR-96-5p靶向调控Tp73基因表达。3.miR-96-5p对PC12细胞的凋亡有调控作用。


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