NaNO_2预处理对过氧化损伤PC12细胞的保护作用

【摘要】：目的:探讨低剂量亚硝酸钠(NaNO_2)预处理对过氧化损伤鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的保护作用;同时观察其诱导PC12细胞分化的作用。 方法:分别以系列浓度的NaNO_2作用PC12细胞不同时间,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测NaNO_2对PC12细胞活力的影响,研究剂量-效应和时间-效应关系,寻找最低促增殖效应剂量和最佳促增殖效应时间。过氧化损伤PC12细胞模型制作采用400 mmol·L~(-1)乙醇、45 mmol·L~(-1) NaNO_2、1.1 mmol·L~(-1)过氧化氢(H_2O_2)处理2 h。细胞增殖指标采用MTT、活细胞计数法、Hoechst33258荧光单染计数有丝分裂指数;细胞凋亡检测采用Hoechst33258染色计数细胞凋亡率、流式细胞术(FITC-annexinⅤ/ PI)双染法和Hoechst 33258/PI活细胞染色法;比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量。Western-blotting检测相关蛋白表达。瑞氏染色观察PC12细胞分化状态。 结果:MTT结果显示,低剂量NaNO_2促进细胞增殖,高剂量抑制其增殖,剂量-效应关系呈典型的倒U型曲线。NaNO_2最低促增殖剂量为(促增殖效应高于对照组的15%)0.14 mmol·L~(-1),最佳促增殖效应时间点出现在第24 h;400 mmol·L~(-1)乙醇、45 mmol·L~(-1)的NaNO_2、1.1 mmol·L~(-1) H_2O_2作用PC12细胞2 h,流式细胞术结果显示,细胞凋亡率分别为(50.63±2.14)%、(52.06±8.32)%、(53.6±8.51)%,用0.14 mmol·L~(-1) NaNO_2预处理细胞24 h,再分别用上述氧化剂作用2 h,细胞凋亡率分别下降为(19.71±3.19)%、(19.65±2.17)%、(18.23±4.19)%差异具有显著性(P﹤0.05);用0.14 mmol·L~(-1) NaNO_2和一氧化氮清除剂(c-PTIO)预处理细胞24 h,再用上述氧化剂作用2 h,细胞凋亡率则分别为(32.28±7.31)%、(38.63±5.08)%、(30.75±3.81)%。Hoechst 33258染色、Hoechst 33258/PI活细胞染色计数细胞死亡率结果与其相似。 用400 mmol·L~(-1)乙醇作用PC12细胞2 h,SOD、CAT酶活性,GSH-Px、MDA含量分别为(20.95±1.68) U/mg. Prot、(11.45±0.93) U/mg. Prot、(41.17±2.72)μmol/mg. Prot、(98.38±11.5)μmol/mg .Prot,用NaNO_2预处理细胞再用乙醇作用,SOD、CAT酶活性和GSH-Px、MDA含量分别为(62.38±2.98)U/mg. Prot、(19.29±0.27) U/mg. Prot、(62.59±1.41)μmol/mg.Prot、(49.38±2.93)μmol/mg.Prot;用NaNO_2+c-PTIO预处理细胞24 h,再用乙醇作用2 h,SOD、CAT酶活性和GSH-Px、MDA含量分别为(40.23±1.57)U/mg.Prot、(15.98±1.9) U/mg.Prot、(51.21±1.52)μmol/mg.Prot、(73.58±14.7)μmol/mg.Prot。用NaNO_2预处理再用乙醇作用组,与单纯乙醇组相比,Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量降低,Bcl-2和HIF~(-1)α蛋白表达量升高(P﹤0.05);c-PTIO可以部分逆转这种现象。45 mmol·L~(-1) NaNO_2和1.1 mmol·L~(-1) H_2O_2处理细胞,上述各指标变化情况与乙醇组一致。瑞氏染色结果显示,0.14 mmol·L~(-1) NaNO_2作用PC12细胞48 h,明显促进PC12细胞突起生长,缺氧诱导因子(HIF~(-1)α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达量增加,作用效果类似神经生长因子(NGF)。c-PTIO可以部分抑制这种现象。 结论: 1.低剂量NaNO_2促进PC12细胞增殖,高剂量抑制其增殖,剂量-效应关系呈典型的倒U型曲线。 2.低剂量NaNO_2预处理能够使PC12细胞抗氧化酶活性增强、脂质过氧化水平降低、HIF~(-1)α的表达增加,对过氧化损伤的细胞有保护作用。 3.低剂量NaNO_2可以促进PC12细胞分化。